1-9 A-D E-G H-M N-P Q-S T-Z


CAS No.: 21442-01-3

N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide); HPMA; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methyl-prop-2-enamide; 2-Hydroxypropyl methacrylate; 27813-02-1; 2-Hydroxypropylmethacrylate; 923-26-2; HPMA; beta-Hydroxypropyl methacrylate; Acryester HP; 2-Hydroxypropyl 2-methylacrylate; Poly(2-hydroxypropyl methacrylate); 2-Hydroxypropyl 2-methyl-2-propenoate; 2-Propenoic acid, 2-methyl-, 2-hydroxypropyl ester; Propylene glycol monomethacrylate; 2-HPMA; CHEBI:53440; 2HPMA; METHACRYLIC ACID, 2-HYDROXYPROPYL ESTER; EINECS 213-090-3; 25703-79-1; methacrylic acid 2-hydroxypropyl ester; BRN 1752228; 2-hydroxy-n-propyl methacrylate; 2-hydroxy-3-propyl methacrylate; 2-Propenoic acid, 2-methyl-, 2-hydroxypropyl ester, homopolymer; Methacrylic Acid Hydroxypropyl Ester; MFCD00004536; DSSTox_CID_5934; W-100292; 2-hydroxypropyl 2-methylprop-2-enoate; 2-Hydroxypropyl methacrylate homopolymer; Hydroxypropyl methacrylate, 97+%, mixture of isomers, stabilized; ACMC-20ah6g; Epitope ID:131322; 2-Propenoic acid, 2-methyl-, monoester with 1,2-propanediol, homopolymer; DSSTox_RID_77971; DSSTox_RID_78619; DSSTox_RID_78792; DSSTox_GSID_25934; DSSTox_GSID_27936; DSSTox_GSID_29629; SCHEMBL19017; 9086-85-5; KSC205K5R; CHEMBL1873783; DTXSID1029629; Methacrylic acid 2-hydroxypropyl; .beta.-hydroxypropyl methacrylate; CTK1A5558; 1,2-Propanediol, 1-methacrylate; 2-Hydroxypropyl 2-methylacrylate #; KS-00000VL9; Tox21_200694; Tox21_201232; Tox21_202531; ANW-73190; AKOS015899917; FCH1116000; LS-1083; ACM27813021; NCGC00090806-01; NCGC00090806-02; NCGC00090806-03; NCGC00258248-01; NCGC00258784-01; NCGC00260080-01; AK105956; AS-59279; CAS-923-26-2; CC-11007; LS-89931; AX8019918; CAS-25703-79-1; CAS-27813-02-1; FT-0694519; M0512; NS00014926; 128399-EP2277565A2; 128399-EP2277566A2; 128399-EP2277567A1; 128399-EP2277568A2; 128399-EP2277569A2; 128399-EP2277570A2; 128399-EP2292280A1; 128399-EP2295401A2; 140484-EP2277565A2; 140484-EP2277566A2; 140484-EP2277567A1; 140484-EP2277568A2; 140484-EP2277569A2; 140484-EP2277570A2; 140484-EP2292280A1; 2-Propenoic acid,2-methyl-,2-hydroxypropyl ester; C-33889; Hydroxypropyl methacrylate(7.4cp(30 degrees c)); Q27124054; N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide; 21442-01-3; N-(2-hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enamide; 2-Propenamide,N-(2-hydroxypropyl)-2-methyl-; Poly(n-(2-hydroxypropyl)methacrylamide); 2-Propenamide, N-(2-hydroxypropyl)-2-methyl-; N-(2-HYDROXYPROPYL) METHACRYLAMIDE; Duxon; UNII-R3F262Z4E0; R3F262Z4E0; N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide polymer; SCHEMBL16097; CTK4E6787; KS-00002BES; DTXSID30944024; FCH920532; MFCD00080531; AKOS006344692; HY-W077028; SS-4855; VZ32912; 40704-75-4; OR311087; 2-Hydroxypropyl methacrylamide, 99% (GC); DB-045587; CS-0115777; FT-0602791; N-(2-hydroxypropyl)-2-methyl-2-propenamide; X3687; 2-methyl-N-(2-oxidanylpropyl)prop-2-enamide; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methyl-prop-2-enamide; A815380; C-02233; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enimidic acid; Q27287739; 2-Propenamide, N-(2-hydroxypropyl)-2-methyl-, homopolymer; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methyl-prop-2-enamide, AldrichCPR; rocryl410; Photomer 2317; 2-Hydroxypropyl meth; HYDROXYPROPYL METHACRYLATE; Hydroxy propyl ethacrylate; 2-HYDROXYPROYL METHACRYLATE; 2-HYDROXYPROPYL METHACRYLATE; Methacrylsurehydroxypropylester; Hydroxypropyl Methacrylate HPMA; Hydroxypropyl Methacrylate; S-(2-HYDROXYPROPYL)MERCAPTURIC ACID; N-ACETYL-S-(2-HYDROXYPROPYL)CYSTEINE, DICYCLOHEXYLAMMONIUM SALT; S-(2-Hydroxypropyl)mercapturic Acid, HPMA;N-Acetyl-3-[(2-hydroxypropyl)thio]alanine DicyclohexylaMMoniuM Salt; N-Acetyl-S-(2-hydroxypropyl)-L-Cysteine Dicyclohexylammonium Salt; doxorubicin-HPMA; doxorubicin-HPMA copolymer conjugate; HPMA-doxorubicin; 1-methacryloylamino-2-hydroxypropane; N-(2-HYDROXYPROPYL)METHACRYLAMIDE; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methyl-prop-2-enamide; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methyl-prop-2-enamide AldrichCPR; 2-Hydroxypropyl methacrylamide 99% (GC); 2-Hydroxypropyl methacrylamide; 2-Propenamide,N-(2-hydroxypropyl)-2-methyl-; N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide); HPMA; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methyl-prop-2-enamide; 2-Hydroxypropyl methacrylate; 27813-02-1; 2-Hydroxypropylmethacrylate; 923-26-2; HPMA; beta-Hydroxypropyl methacrylate; Acryester HP; 2-Hydroxypropyl 2-methylacrylate; Poly(2-hydroxypropyl methacrylate); 2-Hydroxypropyl 2-methyl-2-propenoate; 2-Propenoic acid, 2-methyl-, 2-hydroxypropyl ester; Propylene glycol monomethacrylate; 2-HPMA; CHEBI:53440; 2HPMA; METHACRYLIC ACID, 2-HYDROXYPROPYL ESTER; EINECS 213-090-3; 25703-79-1; methacrylic acid 2-hydroxypropyl ester; BRN 1752228; 2-hydroxy-n-propyl methacrylate; 2-hydroxy-3-propyl methacrylate; 2-Propenoic acid, 2-methyl-, 2-hydroxypropyl ester, homopolymer; Methacrylic Acid Hydroxypropyl Ester; MFCD00004536; DSSTox_CID_5934; W-100292; 2-hydroxypropyl 2-methylprop-2-enoate; 2-Hydroxypropyl methacrylate homopolymer; Hydroxypropyl methacrylate, 97+%, mixture of isomers, stabilized; ACMC-20ah6g; Epitope ID:131322; 2-Propenoic acid, 2-methyl-, monoester with 1,2-propanediol, homopolymer; DSSTox_RID_77971; DSSTox_RID_78619; DSSTox_RID_78792; DSSTox_GSID_25934; DSSTox_GSID_27936; DSSTox_GSID_29629; SCHEMBL19017; 9086-85-5; KSC205K5R; CHEMBL1873783; DTXSID1029629; Methacrylic acid 2-hydroxypropyl; .beta.-hydroxypropyl methacrylate; CTK1A5558; 1,2-Propanediol, 1-methacrylate; 2-Hydroxypropyl 2-methylacrylate #; KS-00000VL9; Tox21_200694; Tox21_201232; Tox21_202531; ANW-73190; AKOS015899917; FCH1116000; LS-1083; ACM27813021; NCGC00090806-01; NCGC00090806-02; NCGC00090806-03; NCGC00258248-01; NCGC00258784-01; NCGC00260080-01; AK105956; AS-59279; CAS-923-26-2; CC-11007; LS-89931; AX8019918; CAS-25703-79-1; CAS-27813-02-1; FT-0694519; M0512; NS00014926; 128399-EP2277565A2; 128399-EP2277566A2; 128399-EP2277567A1; 128399-EP2277568A2; 128399-EP2277569A2; 128399-EP2277570A2; 128399-EP2292280A1; 128399-EP2295401A2; 140484-EP2277565A2; 140484-EP2277566A2; 140484-EP2277567A1; 140484-EP2277568A2; 140484-EP2277569A2; 140484-EP2277570A2; 140484-EP2292280A1; 2-Propenoic acid,2-methyl-,2-hydroxypropyl ester; C-33889; Hydroxypropyl methacrylate(7.4cp(30 degrees c)); Q27124054; N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide; 21442-01-3; N-(2-hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enamide; 2-Propenamide,N-(2-hydroxypropyl)-2-methyl-; Poly(n-(2-hydroxypropyl)methacrylamide); 2-Propenamide, N-(2-hydroxypropyl)-2-methyl-; N-(2-HYDROXYPROPYL) METHACRYLAMIDE; Duxon; UNII-R3F262Z4E0; R3F262Z4E0; N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamide polymer; SCHEMBL16097; CTK4E6787; KS-00002BES; DTXSID30944024; FCH920532; MFCD00080531; AKOS006344692; HY-W077028; SS-4855; VZ32912; 40704-75-4; OR311087; 2-Hydroxypropyl methacrylamide, 99% (GC); DB-045587; CS-0115777; FT-0602791; N-(2-hydroxypropyl)-2-methyl-2-propenamide; X3687; 2-methyl-N-(2-oxidanylpropyl)prop-2-enamide; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methyl-prop-2-enamide; A815380; C-02233; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enimidic acid; Q27287739; 2-Propenamide, N-(2-hydroxypropyl)-2-methyl-, homopolymer; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methyl-prop-2-enamide, AldrichCPR; rocryl410; Photomer 2317; 2-Hydroxypropyl meth; HYDROXYPROPYL METHACRYLATE; Hydroxy propyl ethacrylate; 2-HYDROXYPROYL METHACRYLATE; 2-HYDROXYPROPYL METHACRYLATE; Methacrylsurehydroxypropylester; Hydroxypropyl Methacrylate HPMA; Hydroxypropyl Methacrylate; S-(2-HYDROXYPROPYL)MERCAPTURIC ACID; N-ACETYL-S-(2-HYDROXYPROPYL)CYSTEINE, DICYCLOHEXYLAMMONIUM SALT; S-(2-Hydroxypropyl)mercapturic Acid, HPMA;N-Acetyl-3-[(2-hydroxypropyl)thio]alanine DicyclohexylaMMoniuM Salt; N-Acetyl-S-(2-hydroxypropyl)-L-Cysteine Dicyclohexylammonium Salt; doxorubicin-HPMA; doxorubicin-HPMA copolymer conjugate; HPMA-doxorubicin; 1-methacryloylamino-2-hydroxypropane; N-(2-HYDROXYPROPYL)METHACRYLAMIDE; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methyl-prop-2-enamide; N-(2-Hydroxypropyl)-2-methyl-prop-2-enamide AldrichCPR; 2-Hydroxypropyl methacrylamide 99% (GC); 2-Hydroxypropyl methacrylamide; 2-Propenamide,N-(2-hydroxypropyl)-2-methyl- 


This special volume is devoted to N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide (HPMA) copolymers. It is an opportunity to review what was done and identify directions for future research. The HPMA development and data presented will be related mostly to the authors' laboratory, not to overlap with other author's contributions in this volume. The work done with HPMA copolymers as drug carriers, protein, and surface modifiers, and as synthetic components in smart hybrid biomaterials design has been summarized. More details and work from other laboratories may be found in the other chapters in this volume that cover more focused topics.
The choice of HPMA for development as drug carrier was not random. Based on the detailed studies of the relationship between the structure of hydrophilic polymers and their biocompatibility [11-21], we have chosen N-substituted methacrylamides as our target because the α-carbon substitution and the N-substituted amide bond ensured hydrolytic stability of the side-chains. We synthesized a series of compounds trying to identify a crystalline monomer for easy purification and reproducible synthesis. The first crystalline N-substituted methacrylamide we succeeded to synthesize, HPMA, was chosen for future development [22,23].

2.2. First HPMA copolymer drug and/or protein conjugates
Macromolecules are internalized by cells via endocytosis and ultimately localize in the (enzyme rich) lysosomal compartment. Consequently, we developed HPMA copolymers containing enzymatically degradable bonds (Fig. 3) [34]. Oligopeptide side-chains were designed as drug attachment/release sites [35] and shown to be degradable in vivo [36]. An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is nihms159442f3.jpg Open in a separate window Fig. 3 HPMA copolymers containing enzymatically cleavable bonds [30,34,37-45,47-49,55].
The first degradable polymer carriers based on HPMA were also reported at the Polymers in Medicine Microsymposium in the Prague in 1977 [52] and at conferences in Varna [53] and Tashkent [54]. We used the oxidized insulin B chain (it contains two amino groups at positions 1 and 29) to prepare branched, water-soluble HPMA copolymers by reacting insulin B-chain with HPMA copolymers containing side-chains terminated in p-nitrophenyl esters. The polymers were cleavable (Fig. 4), so we chose the sequence 23-25 (Gly-Phe-Phe) from the insulin B-chain (the bond originating at amino acid 25 is cleavable by chymotrypsin) and synthesized branched, soluble high molecular weight enzymatically degradable copolymers containing the Gly-Phe-Phe segments in crosslinks connecting primary chains [38]. The latter type of polymer carrier was evaluated in vivo in rats and it was shown that the branched polymer carrier is degradable and its molecular weight distribution decreases with time following i.v. administration [36]. These experiments demonstrated the possibility to manipulate the intravascular half-life of polymeric carriers based on HPMA.
An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is nihms159442f4.jpg Fig. 4 Branched HPMA copolymers containing the GFF degradable sequence in crosslinks; this sequence mimics the amino acid residues 23-25 of the insulin B chain [38,52]. 2.4. Validation of the targetability of HPMA copolymer-drug conjugates The choice and design of a targeting system has to be based on a sound biological rationale. The design of the first targetable HPMA copolymer was based on the observation [56] that small changes in the structure of glycoproteins lead to dramatic changes in the fate of the modified glycoprotein in the organism. When a glycoprotein (ceruloplasmin) was administered into rats, a long intravascular half-life was observed. However, when the terminal sialic acid was removed from ceruloplasmin, the asialoglycoprotein (asialoceruloplasmin) formed contains side-chains exposing the penultimate galactose units. The intravascular half-life of the latter was dramatically shortened due to the biorecognition of the molecule by the asialoglycoprotein receptor on the hepatocytes. This receptor recognizes galactose and N-acetylgalactosamine moieties [56]. To determine if one can mimic this process with a synthetic macromolecule, we synthesized HPMA copolymers with N-methacryloylglycylglycine p-nitrophenyl ester and attached galactosamine by aminolysis [57]. These copolymers behaved similarly to the glycoproteins and were biorecognizable in vivo (Fig. 5). Their clearance from the bloodstream was related to the N-acylated galactosamine content (1-11 mol%) of the HPMA copolymer [57-59]. Separation of the rat liver into hepatocytes and non-parenchymal cells indicated that the polymer is largely associated with hepatocytes, and density-gradient subcellular fractionation of the liver confirmed that the HPMA copolymers were internalized by liver cells and transported, with time, into the secondary lysosomes [59,60]. It was very important to find that HPMA copolymers containing side-chains terminated in galactosamine and anticancer drug adriamycin also preferentially accumulated in the liver, i.e., it appeared that non-specific hydrophobic interactions with cell membranes did not interfere with the biorecognition by hepatocytes [61]. An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is nihms159442f5.jpg Open in a separate window Fig. 5 Validations of the targetability of HPMA copolymers. N-acylated galactosamine as the targeting moiety was chosen to mimic the glycoprotein-asialoglycoprotein system [57-59]. In parallel, efforts on the targetability of HPMA copolymer-antibody conjugates started. First HPMA copolymer conjugates with polyclonal and monoclonal anti-Thy-1.2 antibodies and anti-FITC (fluorescein isothiocyanate) antibodies were evaluated. Targetable conjugates containing daunomycin were synthesized and in vitro experiments have shown two orders of magnitude enhanced cytotoxicity of the targeted conjugate (when compared to the nontargeted one) [62]. The targetability and activity of anti-Thy1.2 conjugates with HPMA copolymer-daunomycin conjugates was proven in vivo on a mouse model [63]. Anti-Thy1.2 antibodies were also efficient in targeting HPMA copolymer-photosensitizer (chlorin e6) conjugates [64].

2.5. Early interdisciplinary collaborations
At the beginning of the eighties, we started collaborations with coworkers from the biological field: John Lloyd and Ruth Duncan from the University of Keele in United Kingdom, and Blanka Říhová from the Institute of Microbiology in Prague. The collaboration with the Keele group was initiated by Helmuth Ringsdorf who gave a lecture at the 1977 Prague symposium (where Kopecek presented first HPMA copolymer-drug conjugates and biodegradable carriers based on HPMA). After the meeting Ringsdorf suggested to Lloyd to contact Kopecek because he thought that the collaboration would be beneficial for both. Kopecek met Lloyd in Dresden in July 1978 and they agreed on the evaluation of HPMA copolymer conjugates. First samples were synthesized (different side-chains terminated in p-nitroanilide as drug model) and evaluated at Keele for their cleavability by lysosomal enzymes [42,65] and their stability in blood plasma and serum [46]. More than 300 different polymer structures containing oligopeptide sequences were synthesized in the Prague laboratory [24,25,35,47], and biological properties of a number of them evaluated at Keele within a 10 year period [66,67]. The collaboration with Vladimír Kostka and coworkers from the Institute of Organic Chemistry and Biochemistry in Prague on the cleavability of peptide sequences in HPMA copolymers by cathepsin B [44, Fig. 4], the most important lysosomal cysteine proteinase, resulted in the identification of GFLG sequence, which is incorporated in all conjugates used in clinical trials. From the two fastest cleaving oligopeptides, GFLG and GFTA (see Fig. 3, example 5), we have chosen the GFLG sequence over the GFTA to avoid T; at that time we were worried about the potential immunogenicity. In 1978 Kopecek gave a lecture at the Institute of Microbiology in Prague. After the lecture he discussed with Říhová and the collaboration with her group on the immunogenicity/biocompatibility [69-72] and biorecognition (targeting) [62-64] of HPMA conjugates commenced. These collaborations resulted in the filing of "Polymeric drugs" patent application in 1985 [68]. Kopecek coined the name for the HPMA copolymers evaluated in clinical trials as PK1 and PK2(P for Prague, K for Keele) (Fig. 6). An external file that holds a picture, illustration, etc Object name is nihms159442f6.jpg
Structures of PK1 and PK2, first HPMA copolymers evaluated in clinical trials [68]. Conjugate PK1 contains doxorubicin bound to HPMA copolymer via a tetrapeptide sequence stable in the blood stream but susceptible to enzymatically catalyzed hydrolysis in the lysosomes. Conjugate PK2 contains in addition side-chains terminated in N-acylated galactosamine complementary to the asialoglycoprotein receptor on hepatocytes.

3. HPMA copolymer-drug conjugates
The early experiments provided the foundation for the development of HPMA copolymers as drug carriers. As in the majority of new scientific areas, the research initially focused on the accumulation of basic data on the structure-properties relationship. The summary of research in areas we consider important for the development of clinically relevant HPMA copolymer conjugates follows:
HPMA copolymer-drug conjugates are nanosized (5-20 nm) water-soluble constructs. Their unique structural, physicochemical, and biological properties are advantageous when compared to low molecular weight drugs. The concept of targeted polymer-drug conjugates was developed to address the lack of specificity of low molecular weight drugs for cancer cells. 
The efficiency of extravasation into solid tumors depends on the concentration gradient between the vasculature and tumor tissue and time. Consequently, high molecular weight (long-circulating) polymer conjugates accumulate efficiently in tumor tissue [85] due to the EPR effect [79,100]. However, if they possess a non-degradable backbone, they may deposit and accumulate in various organs [18]. We have previously synthesized high molecular weight carriers by connecting HPMA chains via lysosomally degradable oligopeptide sequences [34] to form water-soluble branched conjugates [36,38-41,101-103]. Following intravenous (i.v.) administration to rats, the oligopeptide crosslinks were cleaved and the resulting lower molecular weight polymer chains were excreted into the urine [36]. These water-soluble copolymers were synthesized by crosslinking (short of gel point) of HPMA copolymer precursors (containing oligopeptide side-chains terminated in a reactive ester group) with diamines.
Later, we designed a new, reproducible synthetic pathway for long-circulating HPMA copolymers [85,104]. New crosslinking agents were synthesized and high molecular weight copolymers prepared by crosslinking copolymerization. The composition of the monomer mixture, however, has to be such that at the end of the polymerization the system is short of the gel point (water-soluble). This method [104] is also suitable for the synthesis of HPMA copolymers, which contain, in addition to oligopeptide crosslinks, oligopeptide side-chains terminated in doxorubicin (DOX) (or other anticancer drugs).
The influence of the molecular weight of such conjugates on their biological activity was evaluated [85]. Copolymerization of HPMA, a polymerizable derivative of DOX (N-methacryloylglycylphenylalanylleucylglycyl doxorubicin) and a crosslinking agent, N2,N5-bis(N-methacryloylglycylphenylalanylleucylglycyl) ornithine resulted in high molecular weight, branched, water-soluble HPMA copolymers containing lysosomally degradable oligopeptide sequences in the crosslinks as well as in side-chains terminated in DOX. Four conjugates with Mw of 22, 160, 895, 1230 kDa were prepared. Biodistribution of the conjugates and their treatment efficacy in nu/nu mice bearing s.c. human ovarian OVCAR-3 carcinoma xenografts were determined (Fig. 7). The half-life of conjugates in the blood was up to 5 times longer and the elimination rate from the tumor was up to 25 times slower as the Mw of conjugates increased from 22 to 1230 kDa. The treatment with HPMA copolymer-bound DOX possessing an Mw higher than 160 kDa inhibited the tumor growth more efficiently than that of 22 kDa or free DOX(p<0.02). The data clearly indicated that the higher the molecular weight of the conjugate the higher the treatment efficacy of human ovarian xenografts in nu/nu mice [85].
An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is nihms159442f7.jpg Open in a separate window Fig. 7 Long-circulating HPMA copolymer-DOX (P-DOX) conjugates of different molecular weight (Mw). (A) Chemical structure of HPMA copolymer-doxorubicin conjugate containing glycylphenylalanylleucylglycine side-chains and N2,N5-bis(N-methacryloylglycylphenylalanylleucylglycyl)ornithine crosslinker [104]; (B) concentration of DOX in OVCAR-3 carcinoma xenografts in nu/nu mice after i.v. bolus of free DOX or P-DOX of different Mw; (C) growth inhibition of s.c. human ovarian OVCAR-3 carcinoma xenografts in nu/nu mice by long-circulating P-DOX conjugates. The mice received i.v. injection of 2.2 mg/kg DOX equivalent dose as P-DOX of different Mw [85].
We hypothesized that HPMA copolymer-bound DOX [P(GFLG)- DOX] (P is the HPMA copolymer backbone) would behave differently than free DOX during long term incubation with cancer cells. To verify the hypothesis, we have studied the effect of free DOX and P(GFLG)- DOX on the induction of multidrug resistance and changes in metabolism in human ovarian carcinoma A2780 cells during repeated cyclic (chronic) exposure [111]. Such experiments are of therapeutic relevance. The development of multidrug resistance during adaptation of sensitive human ovarian carcinoma A2780 cells to free DOX and P(GFLG)-DOX was analyzed. Adaptation of sensitive A2780 cells to repeated action of free DOX augmented cellular resistance to DOX and finally led to the over-expression of the MDR1 gene. On the other hand, P(GFLG)-DOX induced neither the multidrug resistance with or without MDR1 gene expression, nor the adaptation of the sensitive A2780 cells to free DOX [111].
An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is nihms159442f8.jpg Fig. 8 Effect of free DOX (squares) and HPMA copolymer-bound DOX (triangles) on the growth of sensitive A2780 and multidrug resistant A2780/AD human ovarian carcinoma xenografts in female nu/nu mice. Mice were treated i.p. 6 times over 3 weeks (1st and 4th day of each week) with the maximum tolerated dose of free DOX (5 mg/kg) and P(GFLG)- DOX (25 mg/kg). Circles - control tumor. Means±SE are shown [89].
Finally, we have demonstrated the advantages of targeted combination chemotherapy and photodynamic therapy using OV-TL16- targeted HPMA copolymer-DOX and HPMA copolymer-mesochlorin e6 conjugates. OV-TL16 antibodies are complementary to the OA-3 antigen (CD47) present on the majority of ovarian cancers. The immunoconjugates (Fig. 9) preferentially accumulated in human ovarian carcinoma OVCAR-3 xenografts in nude mice with a concomitant increase in therapeutic efficacy when compared with non-targeted conjugates [83]. The targeted conjugates suppressed tumor growth for the entire length of the experiment (>60 days; unpublished data).
An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is nihms159442f9.jpg Open in a separate window Fig. 9 Efficacy of combination chemotherapy and photodynamic therapy of OVCAR-3 xenografts in nude mice with non-targeted and OV-TL16 antibody-targeted HPMA copolymer conjugates. Therapeutic efficacy of combination therapy of HPMA copolymer-bound Mce6 (P(GFLG)-Mce6) and DOX (P(GFLG)-DOX) targeted with OV-TL 16 antibodies toward OVCAR-3 xenografts was compared to non-treated xenografts and non-targeted combination chemotherapy and photodynamic therapy. Equivalent doses of targeted combination therapy enhanced the tumor-suppressive effect as compared to non-targeted combination therapy. Dose administered: 2.2 mg/kg DOX equivalent and 1.5 mg/kg Mce6 equivalent. Irradiation for photodynamic therapy: 650 nm, 200 mW/cm2 18 h after administration [83, unpublished].
The combination index (CI) analysis was used to quantify the synergism, antagonism, and additive effects of binary combinations of free and HPMA copolymer-bound anticancer drugs, 2,5-bis(5-hydroxymethyl- 2-thienyl)furan (SOS), DOX, and mesochlorin e6 mono-ethylenediamine (Mce6) in anticancer effect toward human renal carcinoma A498 cells. The combination of SOS+DOX proved to be synergistic over all cell growth inhibition levels. All other combinations exhibited synergism in a wide range of drug effect levels [117]. Similarly, the targeted (using Fab′ of OV-TL16 antibody) and nontargeted targeted HPMA copolymer-drug conjugates, P(GFLG)-Mce6 and P(GFLG)-SOS, were evaluated against human ovarian carcinoma OVCAR-3 cells. The observations that most combinations produced synergistic effects will be important for clinical translation [118].
In collaboration with Satchi-Fainaro's laboratory at the University of Tel Aviv a new therapeutic strategy for bone neoplasms using combined targeted polymer-bound angiogenesis inhibitors was developed [119]. The aminobisphosphonate alendronate (ALN), and the potent anti-angiogenic agent TNP-470 were conjugated with HPMA copolymer. Using reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization, we synthesized a HPMA copolymer-ALN-TNP-470 conjugate bearing a cathepsin K-cleavable linker, a protease overexpressed in bone tissues. Free and conjugated ALNTNP- 470 demonstrated their synergistic anti-angiogenic and antitumor activity by inhibiting proliferation, migration and capillary-like tube formation of endothelial and osteosarcoma cells. The bi-specific HPMA copolymer conjugate reduced vascular hyperpermeability and remarkably inhibited human osteosarcoma growth in mice by 96%. These findings indicate that HPMA copolymer-ALN-TNP-470 is the first narrowly dispersed anti-angiogenic conjugate synthesized by RAFT polymerization that targets both the tumor epithelial and endothelial compartments warranting its use on osteosarcomas and bone metastases (Fig. 10) [119].
Inhibition of MG-63-Ras human osteosarcoma growth in mice by HPMA copolymer-ALN-TNP470 conjugate. (A) Structure of the conjugate; (B) effects of free (open triangles) or conjugated (closed triangles) ALN and TNP-470 on MG-63-Ras human osteosarcoma tumor growth compared to vehicle-treated group (closed squares) and dissected tumors images. Scale bar represents 10 mm. Data represent mean±S.E. (n=5 mice per group). Adapted from [119].

3.4. Novel targeting strategies
As discussed in 3.1, HPMA copolymer-drug conjugates accumulate passively in solid tumors as a result of the (molecular weight dependent) enhanced permeation and retention (EPR) effect [85]. Active targeting of HPMA copolymer-drug conjugates can be achieved with the incorporation of cancer cell-specific ligands, such as carbohydrates, lectins, antibodies, antibody fragments, and peptides, resulting in enhanced uptake of conjugates by cancer cells through receptor-mediated endocytosis with concomitant improvement of therapeutic efficacy [120,121].
Among different cancer targeting molecules, peptides are of particular interest. Enhanced peptide targeting efficiency can be achieved through multivalent interactions [122] between targets and HPMA copolymer-peptide conjugates containing multiple copies of peptides within a single polymer chain (Fig. 11) [123].
Multivalency effect in the biorecognition of HPMA copolymer-peptide-DOX conjugates. Inhibition of Raji B cell growth by exposure to HPMA copolymer-DOX (P (GFLG)-DOX) conjugate containing varying amount of targeting peptide, EDPGFFN-VEIPEF, per macromolecule. (A) Structure of conjugate; (B) inhibition of Raji B cell growth by P(GFLG)-DOX (no targeting peptide), P(GFLG)-DOX containing 1.9 mol% targeting peptide, and P(GFLG)-DOX containing 3.9 mol% targeting peptide. Adapted from [123].
Combinatorial approaches, such as phage display or synthetic peptide libraries, are suitable for the identification of targeting peptides. Overexpression of the CD21 receptor was found on lymphoblastoid cell lines such as Raji cells; consequently, we have used these techniques to identify targeting moieties for lymphomas [124,125]. With phage display, five distinctive peptides (RMWPSSTVNLSAGRR, PNLDFSPTCSFRFGC, GRVPSMFGGHFFFSR, RLAYWCFSGLFLLVC, and PVAAVSFVPYLVKTY) were identified as ligands of CD21 receptor. The dissociation constants of selected peptides were determined to be in the micromolar range [124]. Using a synthetic chemical combinatorial technique, one-bead one-compound (OBOC) method, we identified four heptapeptides (YILIHRN, PTLDPLP, LVLLTRE, and IVFLLVQ) as ligands for the CD21 receptor [125]. The dissociation constants were found to be similar to peptides selected by phage display. Importantly, the peptides retained their biorecognizability towards CD21 receptor after they were conjugated to HPMA copolymers and demonstrated a multivalency effect [125]. Several peptide-targeted HPMA copolymer- drug conjugates displayed anticancer activity [123,126,127]. The combinatorial chemistry approach (OBOC), when combined with a high-stringency screening method, is able to identify peptides with a picomolar affinity [128,129].

3.4.1. Oral, colon-specific delivery of drugs
The development of drug delivery systems capable of selective release of drug in the colon has received much attention. Site-specific delivery to the colon can be achieved by the exploitation of the microbial enzyme activities present predominantly in the colon. The colon has a concentration of microorganisms 5 orders of magnitude greater than the small intestine or stomach. Some of the enzymatic activity produced by microorganisms in the colon, e.g., azoreductase and glycosidase activities do not overlap with the enzymatic activities in the upper GI tract. The azoreductase activities have been studied in detail and used to convert low molecular weight prodrugs into active metabolites in the colon as well as to release active species from water-soluble polymeric carriers [130]. To achieve colon-specific delivery, a (aromatic amino group-containing) drug may be attached to HPMA copolymer side-chains via an aromatic azo bond cleavable by the azoreductase activities present in the colon [51,131-138]. For example, the release of 5-aminosalicylic acid bound to HPMA copolymers via an aromatic azo bond was demonstrated using Streptococcus faecium, an isolated strain of bacteria commonly found in the colon [131], the cecum contents of rats, guinea pigs, and rabbits [133], and in human feces [133].
Recently, we concentrated on the oral delivery of 9-aminocamptothecin (9-AC). First, we attached 9-AC to HPMA copolymers through a spacer containing an aromatic azo bond and amino acid residues [134,135]. It was shown that the aromatic azo bond was cleaved first in vitro [134] and in vivo [135], followed by peptidase-catalyzed cleavage of the amino acid (dipeptide) drug derivative resulting in the release of free 9-AC. However, the cleavage of the peptide drug derivative was not fast enough to achieve high concentrations of free 9-AC in the colon. These results indicated that conjugates containing a spacer with a faster 9-AC release rate need to be designed. To this end, a monomer containing 9-AC, an aromatic azo bond and a 1,6- elimination spacer was designed and synthesized [51]. The combination of the colon-specific aromatic azo bond cleavage and 1,6- elimination reaction resulted in a fast and highly efficient release of unmodified 9-AC from the HPMA copolymer conjugate by cecal contents in vitro, with concomitant stability in simulated upper GI tract conditions. The conjugate possessed a favorable pharmacokinetics [136,137] and was effective in colon cancer models (Fig. 12) [138].
HPMA copolymer-9-aminocamptothecin conjugate. (A) Structure and scheme of release of unmodified 9-AC from HPMA copolymer-9-AC conjugates by a two-step process - rate controlling aromatic azo bond cleavage, followed by fast 1,6-elimination [51]; (B) survival curves of mice bearing human colon carcinoma xenografts treated by 9-AC and P-9-AC at a dose of 3 mg/kg of 9-AC or 9-AC equivalent [138]. Targeting in the gastrointestinal tract
Cell-surface glycoproteins reflect the stage of differentiation and maturity of colon epithelial cells. Diseased tissues, carcinomas and pre-cancerous conditions such as inflammatory bowel disease, have altered glycoprotein expression when compared to healthy ones. Consequently, lectins may be used as targeting moieties for polymer-bound drugs [139-141]. Whereas WGA (wheat germ agglutinin) binds to healthy tissues, PNA (peanut agglutinin) binds to diseased tissues. We hypothesized that HPMA copolymer-lectin-drug conjugates could deliver therapeutic agents to diseased tissues by targeting colonic glycoproteins. We examined biorecognition of free and HPMA copolymer-conjugated WGA and PNA and anti-Thomsen-Friedenreich (TF) antigen antibody binding in normal neonatal, adult and diseased rodent tissues, human specimens of inflammation and Barrett's esophagus. Neonatal WGA binding was comparable to the adult, with additional luminal columnar cell binding. PNA binding was more prevalent; luminal columnar cell binding existed during the first 2 1/2 weeks of life. WGA binding was strong in both normal and diseased adult tissues; a slight decrease was noted in disease. PNA binding was minimal in normal tissues; increases were seen in disease. Anti-TF antigen antibody studies showed that PNA was not binding to the antigen. The results suggest that HPMA copolymer-lectin-drug conjugates may provide site-specific treatment of conditions like colitis or Barrett's esophagus [141].
A wide variety of therapeutic agents may benefit by specifically directing them to the mitochondria in tumor cells. To design delivery systems that would enable a combination of tumor and mitochondrial targeting, novel HPMA copolymer-based delivery systems that employ triphenylphosphonium ions as mitochondriotropic agents [147] were developed [142]. Constructs were initially synthesized with fluorescent labels substituting for drug and were used for validation experiments. Microinjection and incubation experiments performed using these fluorescently-labeled constructs confirmed the mitochondrial targeting ability [148]. Subsequently, HPMA copolymer-drug conjugates were synthesized using a photosensitizer mesochlorin e6 (Mce6). Mitochondrial targeting of HPMA copolymer-bound Mce6 enhanced cytotoxicity as compared to non-targeted HPMA copolymer-Mce6 conjugates [142]. Minor modifications may be required to adapt the current design and allow for tumor site-specific mitochondrial targeting of other therapeutic agents.
Novel HPMA copolymer-based delivery systems of this derivative were also synthesized [143]. After internalization of a HPMA copolymer-Cort-Mce6 conjugate (via lysosomally degradable GFLG spacer) by endocytosis, Cort-Mce6 was cleaved, translocated to the cytoplasm, bound to the GR, and translocated to the nucleus [143]. To verify that coupling of cortisol to Mce6 maintains the capacity to form a complex with the cytosolic GR resulting in nuclear localization, we investigated the subcellular fate of the modified drug. Cort-Mce6 was monitored in 1471.1 cells transfected with plasmid that expresses green fluorescent protein labeled glucocorticoid receptor (GFP-GR). Cortisol and Mce6 served as positive and negative controls, respectively. GR translocated to the nucleus after attachment of a glucocorticoid analog (e.g., cortisol). The fluorescent GFP label permits the movement of the GR to be monitored in real time. The data (Fig. 13) clearly indicated the time- and concentration-dependent nuclear localization of cortisol-Lys-Mce6 and cortisol. In contrast, cells incubated with Mce6 did not show any alteration in receptor localization following treatment [143].
We developed a novel method for the substitution of the 17-methoxy group of GDM to introduce a primary amino group that is useful for conjugation with targeting moieties and HPMA copolymer-based drug carriers [158]. HPMA copolymers containing different AR-GDM (AR=3-aminopropyl (AP), 6-aminohexyl (AH), and 3-amino-2-hydroxypropyl (AP(OH)), attached via a lysosomally degradable GFLG spacer, were synthesized and characterized [159]. The cytotoxic efficacy of HPMA copolymer-AR-GDM conjugates depended on the structure of AR-GDM [160].
To verify the hypothesis that P(AP-GDM) [HPMA copolymer-17-(3-aminopropylamino)-17-demethoxy-geldanamycin conjugate] may change the gene expression profiles of low molecular weight GDM derivatives, 32P-macroarray analysis (Clonetech) was employed to evaluate the gene expression profiles in human ovarian carcinoma A2780 cells treated with GDM, AP-GDM and P(AP-GDM) at 2 times 50% cell growth inhibitory concentration (IC50). About 1200 genes related to cancer were evaluated at 6 h and 12 h and three-fold changes in expression were considered significant. Considerable similarities in gene expression profiles were found after AP-GDM and P(AP-GDM) treatments as demonstrated by the hierarchical clustering of the gene expression ratios [91]. However, the outcome was different when individual genes relevant to the mechanism of action of geldanamycin were analyzed. P(AP-GDM)-treated cells showed lower expression of HSP70 and HSP27 compared with AP-GDM up to 12 h. Possibly, internalization pathways and subcellular drug localization of P(AP-GDM), different from low molecular AP-GDM, may modulate the cell stress responses induced by AP-GDM. The results of 32P-macroarray were confirmed by RT-PCR and Western blotting [91]. It is possible that internalization of HPMA copolymer-AP-GDM conjugate via endocytosis may circumvent interactions with external components of the cell, such as plasma membrane, which may be sensitive to stressors and environmental changes (Fig. 15). Similarly, we previously observed that A2780 cells treated with HPMA copolymer-DOX conjugate showed a down-regulation of the HSP70 gene more pronounced than that observed in the cells treated with free DOX [89]. These findings may suggest that conjugation of AP-GDM to HPMA copolymer may be able to modulate the cell stress responses induced by AP-GDM due to differences in its internalization mechanism, subcellular localization, and intracellular concentration gradients [91].

3.7. Cancer: clinical trials
HPMA copolymer-based macromolecular therapeutics have been developed considerably in the last 20 years - numerous conjugates have entered clinical trials for therapeutic validation in the last decade. These include HPMA copolymer-DOX [163-165], HPMA copolymer-DOX-galactosamine [166], HPMA copolymer-camptothecin [167], HPMA copolymer-paclitaxel [168], and HPMA copolymer-platinates [169]. Results from testing of some of these conjugates are promising; hopefully the FDA approval of a first macromolecular therapeutics will occur soon. In Section 4.1 we summarized our ideas on the design principles of second-generation conjugates with enhanced therapeutic potential.

3.8. HPMA copolymer conjugates in the treatment of non-cancerous diseases
HPMA copolymer-drug conjugates may be used also for the treatment of diseases other than cancer. We designed bone-targeted HPMA copolymer-conjugated with a well-established bone anabolic agent (prostaglandin E1; PGE1) for the treatment of osteoporosis and other musculoskeletal diseases [50,170-175]. The biorecognition of the conjugates by the skeleton was mediated by an octapeptide of D-aspartic acid (D-Asp8) or alendronate [170,172].
This system has the potential to deliver the bone anabolic agent, PGE1, specifically to the hard tissues after systemic administration. Once bound to bone, the PGE1 will be preferentially released at the sites of higher turnover rate (greater osteoclasts activity) via cathepsin K (osteoclast specific) catalyzed hydrolysis of a specific peptide spacer and subsequent 1,6-elimination [50,176]. When given in anabolic dosing range, the released PGE1 will activate corresponding EP receptors on bone cells surface to achieve net bone formation. The main features of the design are HPMA copolymer backbone containing cathepsin K-cleavable oligopeptide side-chains (Gly-Gly-Pro-Nle) terminating in either D-Asp8 or in p-aminoben-zyloxycarbonyl- 1-prostaglandin E1, a PGE1 prodrug (Fig. 17A).
Structure of HPMA copolymer-prostaglandin E1-Asp8 conjugate and mechanism of its cleavage by cathepsin K followed by 1,6-elimination (A) [50]; Bone formation measured in cancellous bone from the lumbar vertebral bodies in ovariectomized rats 4 weeks after a single injection of 10 mg of the conjugate (n=8) (B) [174].
This novel delivery system has several distinct advantages. First of all, it is a double-targeted delivery system, which contains a bone-binding moiety (D-Asp8) and a cathepsin K (osteoclast specific enzyme) specific releasing mechanism. By directing PGE1 specifically to the skeleton, the side effects of systemic administration of the drug would be greatly reduced. Secondly, E-series prostaglandins (PGEs) are powerful anabolic agents in bone, and this delivery system will better target these molecules to sites in the skeleton with a high turnover rate, where new bone formation would be more beneficial. Thirdly, the system permits improved control of drug concentration at the target (bone) site after systemic administration [171,173]. Fourthly, the polymeric carrier can be eliminated from hard tissues and, subsequently, cleared from the body via kidney glomerular filtration. It also offers proper protection of the conjugated PGE1 from metabolism before it reaches bone tissue. Most recently, we observed the preferential deposition of the proposed delivery system to the bone resorption sites in ovariectomized rats; this strongly supports our higher turnover sites/drug-release hypothesis [172]. In vivo experiments on ovariectomized rats have proven the concept. Following a single i.v. administration of the HPMA copolymer-Asp8-PGE1 conjugate to aged, ovariectomized rats, bone formation rates were substantially greater than controls when measured 28 days later (Fig. 17B) [173]. HPMA copolymer conjugates have been also successful in the treatment of rheumatoid arthritis [175,177].

3.9. Methods of synthesis of HPMA copolymer conjugates
The topic of conjugate synthesis will be extensively covered throughout this volume. We have demonstrated several approaches through this chapter. Consequently, we shall just mention some of the important points, which were not covered.

3.9.1. Hydrolytically cleavable bond between drug and HPMA copolymer
Due to the decreased pH in the endosomes and lysosomes, pH-sensitive bonds are suitable for intracellular drug delivery. We have synthesized HPMA copolymer-adriamycin (ADR=DOX) conjugates where ADR was bound via cis-aconityl bond [177] (Fig. 18). The determination of the cytotoxicity of P(aconityl)-ADR toward A2780 sensitive and A2780/AD resistant human ovarian carcinoma cells indicated that the polymer conjugate could overcome the P-glycoprotein efflux pump expressed in A2780/AD cells [178].

3.9.2. Disulfide-linked HPMA copolymer-mesochlorin e6 conjugates
Novel polymeric delivery systems for the photosensitizer mesochlorin e6 (Mce6) were synthesized to overcome problems of systemic toxicity. A disulfide bond was included to allow for quick release ofMce6 from the HPMA copolymer backbone once internalized in tumor tissue (Fig. 19). Synthesized conjugates demonstrated a time-dependent reductive cleavage with an accompanying increase in the quantum yield of singlet oxygen generation on exposure to dithiothreitol. Faster release kinetics and a higher cytotoxicity in SKOV-3 human ovarian carcinoma cells were obtained as compared to polymer conjugate with a proteolytically cleavable glycylphenylalanylleucylglycyl spacer. These novel conjugates hold promise as clinically relevant drug delivery systems for photodynamic therapy of cancer [179].

3.9.3. Attachment of targeting moieties
The chemistry used for attachment of targeting moieties has an impact on the biorecognition of the conjugate. We compared several methods of antibody attachment (see below), investigated how the attachment of antibodies to HPMA copolymers impacts the mechanism of internalization and subcellular trafficking [180] and designed polymerizable antibody fragments [84].

3.9.4. Polymerizable antibody fragments
An innovative pathway for the synthesis of targeted polymeric drug delivery systems using polymerizable antibody fragments was designed [84]. A new macromonomer, a polymerizable antibody Fab′ fragment (MA-Fab′) of the OV-TL 16 antibody (IgG1) has been synthesized and copolymerized with HPMA to produce poly(HPMA-co- MA-Fab′) (Fig. 20). The concept of using polymerizable Fab′ fragments as macromonomers provides a new paradigm for the synthesis of targeted polymeric drug delivery systems, and may have unique applications in other areas, such as immunoassays, biosensor technology and affinity chromatography [84].

3.9.5. Impact of chemistry of attachment of antibodies to HPMA copolymers on the binding affinity of the conjugates
The influence of different methods of coupling the OV-TL16 antibody and its Fab′ fragment to HPMA copolymer-drug (ADR, Mce6) carriers on the binding affinity of the conjugates to the CD47 antigen associated with ovarian carcinoma (OVCAR-3) cells was studied. Three different methods of covalently binding the Ab or Fab′ to polymers were used [181]. Method A: binding via amide bonds formed by aminolysis of active ester groups on the HPMA copolymer-drug (ADR or Mce6) conjugates by amino groups on the antibody; Method B: binding via hydrazone bonds formed by the reaction of aldehyde groups on the oxidized antibody with hydrazo groups on the HPMA copolymer-Mce6 conjugates; Method C: binding via thioether bonds formed by the reaction of sulfhydryl groups of Fab′ fragments with maleimido groups on the side-chain termini of the HPMA copolymer-Mce6 conjugate. Differences in Ka were observed as shown in Fig. 21.
The synthesis of HPMA copolymer conjugates, especially their molecular weight distribution, can be controlled by methods of living radical polymerization, RAFT (reversible addition-fragmentation chain transfer) [182] and ATRP (atom transfer radical) polymerizations [183]. For example, HPMA copolymer conjugates containing two drugs and one fluorescent label per macromolecule using RAFT copolymerization were recently synthesized [119; Fig. 10].

3.9.7. Attachment of oligonucleotides
Aminolysis of HPMA copolymer precursors can be used for attachment of oligonucleotides to HPMA copolymers. We have attached a 21-mer phosphorothioate oligonucleotide (5′-TTTATAAGGGTCGATGTCCXX-3′) to HPMA copolymers containing GG-ONp and GFLG-ONp (ONp is p-nitrophenoxy) side-chains [184]. The oligonucleotide had a primary amine on the 5′-end and a fluorescein on the 3′-end. The subcellular fate and activity in inhibiting the hepatitis B virus of the HPMA copolymer-phosphorothioate oligonucleotides was studied. Covalently attaching the oligonucleotides to the HPMA copolymers via non-degradable dipeptide GG spacers resulted in sequestering the oligonucleotide in vesicles after internalization. Conjugation of the oligonucleotides to an HPMA copolymer via a lysosomally cleavable tetrapeptide GFLG spacer resulted in release of the oligonucleotide in the lysosome and subsequent translocation into the cytoplasm and nucleus of the cells. The degradable HPMA copolymer-oligonucleotide conjugate possessed antiviral activity indicating that phosphorothioate oligonucleotides released from the carrier in the lysosome were able to escape into the cytoplasm and nucleus and remain active. The Hep G2 cells appeared to actively internalize the phosphorothioate oligonucleotides as oligonucleotide -HPMA copolymer conjugates were internalized to a greater extent than unconjugated polymers [184].

3.9.8. Attachment of cell penetrating peptides (CPP)
These peptides, such as the Tat peptide (48GRKKRRQRRR57) which originates from HIV-1 Tat protein, a potent activator of HIV-1 transcription, have been attached using various chemical designs. One approach is to add several amino acid residues, e.g. to produce 48GRKKRRQRRR57YK(FITC)C. The latter may be attached to HPMA copolymer side-chains terminated in maleimide via thioether bonds [185]. We have recently reviewed the biological implications of CPP attachment [144], so we shall not discuss it here.
4.1. Modification with semitelechelic poly(HPMA)
Poly(HPMA) [189] exhibits similar properties as poly(ethylene glycol) [190] when used for modification of enzymes or vesicular carriers. The first report on semitelechelic poly(HPMA) (ST-PHPMA) was published in 1995 [191]. Modification of nanospheres, based on a copolymer of methyl methacrylate, maleic anhydride, and methacrylic acid, with ST-PHPMA resulted in decreased protein adsorption in vitro and increased intravascular half-life, as well as decreased accumulation in the liver, after intravenous administration into rats. The higher the molecular weight of ST-PHPMA, the more pronounced the changes in these properties (Fig. 22). These data seem to indicate the influence of the hydrodynamic thickness of the coating layer on the process of opsonization and capture by Kupffer cells of the liver and macrophages of the spleen [191].
First synthesis and application of semitelechelic poly(HPMA) to modify surface of nanospheres. (A) Structure; (B) adsorption isotherms of IgG onto surface-modified P (MMA-MA-MAA) nanospheres in 1/15 M saline at 25 °C for 3 h. Each point represents the mean±SD (n=3); (C) body distribution profiles for unmodified and modified [14C]-P(MMA-MA-MAA) nanospheres in rats 24 h after i.v. administration and the correlation with Mn of ST-PHPMA. Each point represents the mean±SD (n=5) [191].
Similarly, carboxyl and amino group modification of chymotrypsin with ST-PHPMA-CONHNH2 and ST-PHPMA-COOSu (N-hydroxysuccinimide ester) produced conjugates [189] with comparable properties to PEG-modified chymotrypsin [187]. Ulbrich et al. used ST-PHPMA to modify ribonuclease, chymotrypsin [192], and superoxide dismutase [193]. The proteolytic stability of modified protein increased and their immunogenicity decreased [192,193].

4.2. Modification with HPMA copolymers containing multiple reactive side-chains
First protein modified with HPMA copolymers was prepared by the reaction of the copolymer of HPMA with N-methacryloylglycylglycine p-nitrophenyl ester with insulin [28]. The unreacted protein was separated on Sephadex 75; the HPMA copolymer-insulin conjugate exhibited a slower onset and a slight prolongation of hypoglycemic effect in rats when compared to free insulin [28]. Chymotrypsin [29,30] and cobra venom acetylcholinesterase [194] followed.
To obtain a better insight into the steric hindrance of the polymer chains on the formation of enzyme-substrate complex, we have studied the hydrolysis of polymeric substrates (HPMA copolymers with oligopeptide side-chains terminated in p-nitroanilide) catalyzed by HPMA copolymer-bound chymotrypsin. The kinetic analysis showed that the hydrolysis of polymer substrates with polymer-bound chymotrypsin led to a decrease in both kcat and kcat/KM, but the relationship between the individual substrates remained intact. Apparently, the steric effects of two independent polymer chains (one bound to substrate, the other to enzyme) were roughly additive [30].
Different chemistry was used for the modification of cobra venom acetylcholinesterase [194]. The secondary OH groups of poly(HPMA) (Mw 25-30 kDa) were activated with 4-nitrophenyl chloroformate in dimethylformamide followed by attachment of acetylcholinesterase in borate buffer. The poly(HPMA)-modified acetylcholinesterase demonstrated a 70-fold prolongation of enzyme activity in blood after intravenous injection into mice when compared to unmodified enzyme. The thermoinactivation rate of the polyHPMA-acetylcholinesterase conjugate was 74 times smaller than that of native enzyme (Fig. 23) [194].
HPMA copolymer-modified acetylcholinesterase. (A) Structure; (B) enhancement of intravascular half-life in mice after i.v. administration of HPMA copolymer-modified enzyme; (C) augmentation of thermal stability of HPMA copolymer-modified enzyme [194].
HPMA copolymer with N-methacryloylglycylphenylanylleucylglycine p-nitrophenylester was used for the modification of ribonuclease [195] and superoxide dismutase [193]. No difference in biological activity of conjugates prepared using ST-PHPMA and HPMA copolymers with reactive side-chains was detected [193].
There is considerable activity in using HPMA copolymers with reactive side-chains to stabilize complexes of DNA with viruses. This research is covered in the chapter by Seymour in this volume and in our review [196].

5.1. HPMA-based hydrogels
First HPMA-based hydrogels were synthesized by crosslinking copolymerization of HPMA and methylene-bis-acrylamide or ethylene- bis-methacrylamide in the early 70s [197]. The kinetic course of copolymerization, interaction parameter polymer-water, the modulus of elasticity, and concentration of elastically effective chains were characterized.
Degradable hydrogels containing oligopeptide crosslinks susceptible to chymotrypsin-catalyzed hydrolysis were synthesized by crosslinking HPMA copolymers containing reactive side-chains (terminated in p-nitrophenoxy groups) with oligopeptide (GGY, GFY, GLF, AGVY, and AGFY)-containing diamines [49]. The degradability of hydrogels was dependent on the length and detailed structure of the oligopeptide sequence and on the network density, and thus the equilibrium degree of swelling (Fig. 24). The higher the degree of swelling, the faster the rate of degradation. The degree of swelling also has an impact on surface vs. bulk degradation of the hydrogel. If the enzyme cannot diffuse into the hydrogel interior, only surface degradation takes place. This was demonstrated by a comparison of the degradation of HPMA copolymer crosslinked with AGVY-containing sequences catalyzed by chymotrypsin and HPMA copolymer-bound chymotrypsin. Only surface degradation of the hydrogel was observed in the latter case due to the larger size of polymer-modified enzyme [49]. HPMA-based hydrogels containing the sequence GFYAA in the crosslinks were cleavable with cathepsin B, a lysosomal thiol proteinase [44]. In further experiments, HPMA-based hydrogels with degradable crosslinks were shown to release FITC-dextran and daunomycin during incubation with a mixture of lysosomal enzymes (Tritosomes) or chymotrypsin [198].
Crosslinking copolymerization of HPMA with N,O-dimethacryloyl-hydroxylamine produced hydrolytically degradable hydrogels [199]. These hydrogels were used as a depo for anticancer drug (DOX); results of combination therapy using DOX release from hydrogels followed by antibody-targeted therapy has been effective in the treatment of terminal stages of Bcl1 leukemia in mice [200].
Hennink et al. synthesized ABA triblock copolymers, where block A is thermosensitive poly(HPMA lactate) and block B is PEG. Heating of the copolymer results in the formation of a viscoelastic material, which may be stabilized (crosslinked) by photopolymerization [202]. These materials are suitable for protein delivery [203].
Self-assembly of HPMA graft copolymers, CCK-P and CCE-P, into hybrid hydrogels mediated by antiparallel heterodimer coiled-coil formation. Two distinct pentaheptad peptides (CCE and CCK) were designed to create a dimerization motif and serve as physical crosslinkers (P is the HPMA copolymer backbone). Aqueous solutions of CCE-P or CCK-P did not form gels. In contrast, gel-like materials were formed from equimolar mixtures of CCE-P/CCK-P at low concentrations [211].


Bu özel cilt, N- (2-hidroksipropil) metakrilamid (HPMA) kopolimerlerine ayrılmıştır. Neyin yapıldığını gözden geçirmek ve gelecekteki araştırmalar için yön belirlemek için bir fırsattır. HPMA gelişimi ve sunulan veriler, bu ciltteki diğer yazarların katkılarıyla örtüşmeyecek şekilde, çoğunlukla yazarların laboratuvarıyla ilgili olacaktır. İlaç taşıyıcıları, protein ve yüzey değiştiriciler olarak ve akıllı hibrit biyomateryal tasarımında sentetik bileşenler olarak HPMA kopolimerleriyle yapılan çalışmalar özetlenmiştir. Diğer laboratuvarlardan daha fazla ayrıntı ve çalışma, bu cildin daha odaklanmış konuları kapsayan diğer bölümlerinde bulunabilir.
İlaç taşıyıcısı olarak geliştirme için HPMA seçimi rastgele değildi. Hidrofilik polimerlerin yapısı ile biyouyumlulukları [11-21] arasındaki ilişkinin ayrıntılı çalışmalarına dayanarak, hedefimiz olarak N-ikameli metakrilamidleri seçtik çünkü α-karbon ikamesi ve N-ikameli amid bağı hidrolitik stabiliteyi sağladı. yan zincirler. Kolay saflaştırma ve yeniden üretilebilir sentez için bir kristal monomer tanımlamaya çalışan bir dizi bileşik sentezledik. Sentezlemeyi başardığımız ilk kristalin N-ikameli metakrilamid, HPMA, gelecekteki geliştirme için seçildi [22,23].

2.2. İlk HPMA kopolimer ilacı ve / veya protein konjugatları
Makromoleküller, hücreler tarafından endositoz yoluyla içselleştirilir ve nihayetinde (enzim açısından zengin) lizozomal bölmede lokalize olur. Sonuç olarak, enzimatik olarak parçalanabilir bağlar içeren HPMA kopolimerleri geliştirdik (Şekil 3) [34]. Oligopeptid yan zincirleri, ilaç bağlanma / salım bölgeleri olarak tasarlandı [35] ve in vivo bozunabilir olduğu gösterildi [36]. Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms159442f3.jpg Ayrı bir pencerede aç Şekil 3 Enzimatik olarak parçalanabilen bağlar içeren HPMA kopolimerleri [30,34,37-45,47-49,55].
HPMA'ya dayalı ilk bozunabilir polimer taşıyıcılar, 1977'de Prag'daki Polymers in Medicine Microsymposium'da [52] ve Varna [53] ve Taşkent'teki [54] konferanslarda da bildirildi. İnsülin B-zincirini p-nitrofenil esterlerde sonlandırılmış yan zincirler içeren HPMA kopolimerleri ile reaksiyona sokarak dallı, suda çözünür HPMA kopolimerlerini hazırlamak için oksitlenmiş insülin B zincirini (pozisyon 1 ve 29'da iki amino grubu içerir) kullandık. Polimerler bölünebilirdi (Şekil 4), bu yüzden insülin B-zincirinden 23-25 ​​(Gly-Phe-Phe) dizisini seçtik (amino asit 25'ten kaynaklanan bağ kimotripsin tarafından bölünebilir) ve sentezlenmiş dallı, çözünür yüksek birincil zincirleri bağlayan çapraz bağlarda Gly-Phe-Phe segmentlerini içeren moleküler ağırlık enzimatik olarak bozunabilir kopolimerler [38]. İkinci tip polimer taşıyıcı, sıçanlarda in vivo değerlendirildi ve dallı polimer taşıyıcının bozunabildiği ve moleküler ağırlık dağılımının, i.v. yönetim [36]. Bu deneyler, HPMA'ya dayalı polimerik taşıyıcıların intravasküler yarılanma ömrünü değiştirme olasılığını gösterdi.
Bir resim, illüstrasyon, vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms159442f4.jpg'dir. Şekil 4 Çapraz bağlantılarda GFF bozunur sekansı içeren dallanmış HPMA kopolimerleri; bu dizi, insülin B zincirinin 23-25 ​​amino asit kalıntılarını taklit eder [38,52]. 2.4. HPMA kopolimer-ilaç konjugatlarının hedeflenebilirliğinin doğrulanması Bir hedefleme sisteminin seçimi ve tasarımı, sağlam bir biyolojik mantığa dayanmalıdır. İlk hedeflenebilir HPMA kopolimerinin tasarımı, glikoproteinlerin yapısındaki küçük değişikliklerin organizmada modifiye edilmiş glikoproteinin kaderinde dramatik değişikliklere yol açtığı gözlemine [56] dayanıyordu. Sıçanlara bir glikoprotein (seruloplazmin) uygulandığında, uzun bir intravasküler yarı ömür gözlenmiştir. Bununla birlikte, terminal sialik asit seruloplazminden çıkarıldığında oluşan asialoglikoprotein (asialoseruloplazmin), sondan bir önceki galaktoz birimlerini açığa çıkaran yan zincirler içerir. İkincisinin intravasküler yarı ömrü, molekülün hepatositler üzerindeki asialoglikoprotein reseptörü tarafından biyolojik olarak tanınmasına bağlı olarak önemli ölçüde kısalmıştır. Bu reseptör galaktoz ve N-asetilgalaktozamin parçalarını tanır [56]. Bu süreci sentetik bir makromolekül ile taklit edip edemeyeceğimizi belirlemek için, HPMA kopolimerlerini N-metakrililglisilglisin p-nitrofenil ester ile sentezledik ve aminoliz yoluyla galaktozamini ekledik [57]. Bu kopolimerler, glikoproteinlere benzer şekilde davrandılar ve in vivo biyo-tanınabilirdi (Şekil 5). Bunların kan dolaşımından temizlenmesi, HPMA kopolimerinin N-asillenmiş galaktozamin içeriği (% 1-11 mol) ile ilişkiliydi [57-59]. Sıçan karaciğerinin hepatositlere ve parankimal olmayan hücrelere ayrılması, polimerin büyük ölçüde hepatositler ile ilişkili olduğunu gösterdi ve karaciğerin yoğunluk-gradyan hücre altı fraksiyonasyonu, HPMA kopolimerlerinin karaciğer hücreleri tarafından içselleştirildiğini ve zamanla ikincil hücreye taşındığını doğruladı. lizozomlar [59,60]. Galaktozamin ve antikanser ilaç adriamisin ile sonlandırılan yan zincirler içeren HPMA kopolimerlerinin ayrıca tercihli olarak karaciğerde biriktiğini bulmak çok önemliydi, yani hücre zarlarıyla spesifik olmayan hidrofobik etkileşimlerin hepatositler tarafından biyo-tanımaya müdahale etmediği görüldü [61 ]. Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms159442f5.jpg'dir Ayrı bir pencerede açın Şekil 5 HPMA kopolimerlerinin hedeflenebilirliğinin doğrulanması. Hedefleme parçası olarak N-asillenmiş galaktozamin, glikoprotein-asialoglikoprotein sistemini taklit etmek için seçildi [57-59]. Buna paralel olarak, HPMA kopolimer-antikor konjugatlarının hedeflenebilirliği için çabalar başladı. Poliklonal ve monoklonal anti-Thy-1.2 antikorları ve anti-FITC (fluorescein isothiocyanate) antikorları içeren ilk HPMA kopolimer konjugatları değerlendirildi. Daunomisin içeren hedeflenebilir konjugatlar sentezlendi ve in vitro deneyler, hedeflenen konjugatın sitotoksisitesini arttıran iki büyüklük derecesini gösterdi (hedeflenmeyenle karşılaştırıldığında) [62]. Anti-Thy1.2 konjugatlarının HPMA kopolimer-daunomisin konjugatlarıyla hedeflenebilirliği ve aktivitesi, bir fare modelinde in vivo kanıtlanmıştır [63]. Anti-Thy1.2 antikorları, HPMA kopolimer-ışığa duyarlılaştırıcı (klorin e6) konjugatlarının hedeflenmesinde de etkili olmuştur [64].
2.5. Erken disiplinler arası işbirlikleri
Seksenlerin başında, biyolojik alandaki iş arkadaşlarımızla işbirliğine başladık: Birleşik Krallık'taki Keele Üniversitesi'nden John Lloyd ve Ruth Duncan ve Prag'daki Mikrobiyoloji Enstitüsü'nden Blanka Říhová. Keele grubu ile işbirliği, 1977 Prag sempozyumunda bir konferans veren Helmuth Ringsdorf tarafından başlatıldı (Kopecek burada HPMA'ya dayalı ilk HPMA kopolimer-ilaç konjugatlarını ve biyolojik olarak parçalanabilir taşıyıcıları sundu). Toplantıdan sonra Ringsdorf, Lloyd'a Kopecek ile iletişime geçmesini önerdi çünkü işbirliğinin her ikisi için de faydalı olacağını düşündü. Kopecek, Temmuz 1978'de Dresden'de Lloyd ile tanıştı ve HPMA kopolimer konjugatlarının değerlendirilmesi üzerinde anlaştılar. İlk örnekler sentezlendi (ilaç modeli olarak p-nitroanilide sonlandırılan farklı yan zincirler) ve lizozomal enzimler [42,65] tarafından bölünebilirlikleri ve kan plazması ve serumdaki stabiliteleri [46] açısından Keele'de değerlendirildi. Prag laboratuvarında oligopeptid sekansları içeren 300'den fazla farklı polimer yapısı sentezlendi [24,25,35,47] ve bunların bir kısmının biyolojik özellikleri 10 yıllık bir süre içinde Keele'de değerlendirildi [66,67]. Vladimír Kostka ve Prag'daki Organik Kimya ve Biyokimya Enstitüsü'nden meslektaşları ile HPMA kopolimerlerindeki peptit dizilerinin en önemli lizozomal sistein proteinaz olan katepsin B [44, Şekil 4] tarafından bölünebilirliği konusunda işbirliği, GFLG'nin tanımlanmasıyla sonuçlandı. klinik deneylerde kullanılan tüm konjugatlara dahil edilen dizi. En hızlı bölünen iki oligopeptitten, GFLG ve GFTA'dan (bakınız Şekil 3, örnek 5), T'yi önlemek için GFTA yerine GFLG dizisini seçtik; o sırada potansiyel immünojenisite konusunda endişeliydik. 1978'de Kopecek, Prag'da Mikrobiyoloji Enstitüsü'nde bir konferans verdi. Konferanstan sonra Říhová ile tartıştı ve grubuyla HPMA konjugatlarının immünojenitesi / biyouyumluluğu [69-72] ve biyo-tanıma (hedefleme) [62-64] üzerine işbirliği başladı. Bu işbirlikleri 1985 yılında "Polimerik ilaçlar" patent başvurusunun yapılmasıyla sonuçlandı [68]. Kopecek, klinik çalışmalarda değerlendirilen HPMA kopolimerlerinin adını PK1 ve PK2 (Prag için P, Keele için K) olarak almıştır (Şekil 6). Resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya Nesne adı nihms159442f6.jpg'dir.
PK1 ve PK2'nin yapıları, ilk HPMA kopolimerleri klinik çalışmalarda değerlendirildi [68]. Konjugat PK1, kan akışında stabil olan ancak lizozomlarda enzimatik olarak katalize edilmiş hidrolize duyarlı bir tetrapeptid dizisi aracılığıyla HPMA kopolimerine bağlanan doksorubisin içerir. Konjugat PK2 ek olarak, hepatositler üzerindeki asialoglikoprotein reseptörüne tamamlayıcı olan N-asillenmiş galaktozamin ile sonlandırılmış yan zincirler içerir.

3. HPMA kopolimer-ilaç konjugatları
İlk deneyler, ilaç taşıyıcıları olarak HPMA kopolimerlerinin geliştirilmesi için temel oluşturdu. Yeni bilimsel alanların çoğunda olduğu gibi, araştırma başlangıçta yapı-özellikler ilişkisi üzerine temel verilerin toplanmasına odaklandı. Klinik olarak ilgili HPMA kopolimer konjugatlarının geliştirilmesi için önemli olduğunu düşündüğümüz alanlardaki araştırmaların özeti aşağıdaki gibidir:
HPMA kopolimer-ilaç konjugatları, nano boyutlu (5-20 nm) suda çözünür yapılardır. Benzersiz yapısal, fizikokimyasal ve biyolojik özellikleri, düşük moleküler ağırlıklı ilaçlarla karşılaştırıldığında avantajlıdır. Hedeflenen polimer-ilaç konjugatları kavramı, kanser hücreleri için düşük moleküler ağırlıklı ilaçların özgüllük eksikliğini gidermek için geliştirilmiştir.
Katı tümörlere ekstravazasyonun etkinliği, vaskülatür ve tümör dokusu arasındaki konsantrasyon gradyanına ve zamana bağlıdır. Sonuç olarak, yüksek moleküler ağırlıklı (uzun sirkülasyonlu) polimer konjugatları EPR etkisine [79,100] bağlı olarak tümör dokusunda [85] verimli bir şekilde birikir. Ancak bozunmayan omurgaya sahiplerse çeşitli organlarda birikebilir ve birikebilirler [18]. Suda çözünür dallı konjugatlar [36,38-41,101-103] oluşturmak için HPMA zincirlerini lizozomal olarak bozunabilir oligopeptid dizileri [34] aracılığıyla bağlayarak daha önce yüksek moleküler ağırlıklı taşıyıcıları sentezledik. Sıçanlara intravenöz (i.v.) uygulamayı takiben, oligopeptit çapraz bağları yarıldı ve ortaya çıkan düşük moleküler ağırlıklı polimer zincirleri idrarla atıldı [36]. Bu suda çözünür kopolimerler, HPMA kopolimer öncülerinin (reaktif bir ester grubunda sonlandırılmış oligopeptit yan zincirleri içeren) diaminlerle çapraz bağlanmasıyla (jel noktasından kısa) sentezlendi.
Daha sonra, uzun süre dolaşan HPMA kopolimerleri için yeni, yeniden üretilebilir bir sentetik yol tasarladık [85,104].
Yeni çapraz bağlama maddeleri sentezlendi ve yüksek moleküler ağırlıklı kopolimerler çapraz bağlanarak kopolimerizasyon ile hazırlandı. Bununla birlikte, monomer karışımının bileşimi, polimerizasyonun sonunda sistemin jel noktasından (suda çözünür) kısa olacağı şekilde olmalıdır. Bu yöntem [104], oligopeptit çapraz bağlarına ek olarak doksorubisin (DOX) (veya diğer antikanser ilaçları) ile sonlandırılan oligopeptit yan zincirlerini içeren HPMA kopolimerlerinin sentezi için de uygundur.
Bu tür konjugatların moleküler ağırlığının biyolojik aktiviteleri üzerindeki etkisi değerlendirildi [85]. DOX'un polimerize edilebilir bir türevi olan HPMA'nın kopolimerizasyonu (N-metakriloilglisilfenilalanilleukilglisil doksorubisin) ve bir çapraz bağlama maddesi, N2, N5-bis (N-metakriloilglisilfenilalanilalanilösililglisil) ornitin içeren kopolimerizasyonu, yüksek moleküler moleküler-moleküler-moleküler-moleküler-moleküler-moleküler-moleküler-moleküler-moleküler-moleküler-moleküler ağırlıklı MA ile sonuçlandı. çapraz bağların yanı sıra DOX'ta sonlandırılan yan zincirlerde. 22, 160, 895, 1230 kDa'lık Mw'ye sahip dört konjugat hazırlandı. Konjugatların biyolojik dağılımı ve s.c. içeren nu / nu farelerde tedavi etkinliği. insan yumurtalık OVCAR-3 karsinom ksenograftları belirlendi (Şekil 7). Kandaki konjugatların yarılanma ömrü 5 kata kadar daha uzundu ve tümörden eliminasyon oranı, konjugatların Mw'si 22'den 1230 kDa'ya çıktıkça 25 kata kadar daha yavaştı. 160 kDa'dan daha yüksek bir Mw'ye sahip HPMA kopolimer bağlı DOX ile tedavi, tümör büyümesini 22 kDa veya serbest DOX'unkinden (p <0.02) daha verimli bir şekilde inhibe etti. Veriler, konjugatın moleküler ağırlığı ne kadar yüksekse, nu / nu farelerde insan yumurtalık ksenograftlarının tedavi etkinliğinin de o kadar yüksek olduğunu açıkça göstermiştir [85].
Bir resim, illüstrasyon, vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms159442f7.jpg Ayrı bir pencerede aç Şekil 7 Farklı moleküler ağırlıktaki (Mw) uzun dolaşan HPMA kopolimer-DOX (P-DOX) konjugatları. (A) Glisilfenilalanilösilglisin yan zincirleri ve N2, N5-bis (N-metakriloilglisilfenilalanilleukilglisil) ornitin çapraz bağlayıcı [104] içeren HPMA kopolimer-doksorubisin konjugatının kimyasal yapısı; (B) i.v.'den sonra nu / nu farelerinde OVCAR-3 karsinom ksenograftlarında DOX konsantrasyonu. serbest DOX veya farklı Mw P-DOX bolusu; (C) s.c.'nin büyüme inhibisyonu nu / nu farelerindeki insan yumurtalık OVCAR-3 karsinom ksenograftları, uzun dolaşan P-DOX konjugatları tarafından. Fareler i.v. 2.2 mg / kg DOX eşdeğer dozunun farklı Mw P-DOX olarak enjeksiyonu [85].
HPMA kopolimer bağlı DOX [P (GFLG) - DOX] (P, HPMA kopolimer omurgasıdır) kanser hücreleri ile uzun süreli inkübasyon sırasında serbest DOX'ten farklı davranacağını varsaydık. Hipotezi doğrulamak için, serbest DOX ve P (GFLG) - DOX'un çoklu ilaç direncinin indüksiyonu üzerindeki etkisini ve tekrarlanan döngüsel (kronik) maruziyet sırasında insan yumurtalık karsinomu A2780 hücrelerinde metabolizmadaki değişiklikleri inceledik [111]. Bu tür deneyler, terapötik açıdan önemlidir. Hassas insan yumurtalık karsinomu A2780 hücrelerinin serbest DOX ve P (GFLG) -DOX'a adaptasyonu sırasında çoklu ilaç direncinin gelişimi analiz edildi. Duyarlı A2780 hücrelerinin, serbest DOX artırılmış hücresel direncin DOX'a tekrarlanan etkisine adaptasyonu ve sonunda MDR1 geninin aşırı ekspresyonuna yol açtı. Öte yandan, P (GFLG) -DOX, MDR1 gen ekspresyonu olan veya olmayan çoklu ilaç direncini veya duyarlı A2780 hücrelerinin serbest DOX'a adaptasyonunu indüklememiştir [111].
Bir resim, illüstrasyon, vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms159442f8.jpg Şekil 8 Serbest DOX (kareler) ve HPMA kopolimer bağlı DOX (üçgenler) 'in hassas A2780 ve çoklu ilaca dirençli A2780 / AD insan büyümesi üzerindeki etkisi dişi nu / nu farelerinde yumurtalık karsinomu ksenograftları. Fareler i.p. Maksimum tolere edilen serbest DOX (5 mg / kg) ve P (GFLG) - DOX (25 mg / kg) dozu ile 3 haftada 6 kez (her haftanın 1. ve 4. günü). Daireler - tümörü kontrol eder. Ortalama ± SE gösterilir [89].
Son olarak, OV-TL16 hedefli HPMA kopolimer-DOX ve HPMA kopolimer-mezoklorin e6 konjugatlarını kullanarak hedefli kombinasyon kemoterapi ve fotodinamik tedavinin avantajlarını gösterdik. OV-TL16 antikorları, yumurtalık kanserlerinin çoğunda bulunan OA-3 antijenine (CD47) tamamlayıcıdır. İmmünokonjugatlar (Şekil 9), hedeflenmemiş konjugatlarla karşılaştırıldığında terapötik etkinlikte eşlik eden bir artışla birlikte çıplak farelerde tercihen insan yumurtalık karsinomu OVCAR-3 ksenograftlarında birikmiştir [83]. Hedeflenen konjugatlar, deneyin tüm uzunluğu boyunca tümör büyümesini baskıladı (> 60 gün; yayınlanmamış veriler).
Bir resim, illüstrasyon vb. İçeren harici bir dosya. Nesne adı nihms159442f9.jpg Ayrı bir pencerede aç Şekil 9 Hedeflenmemiş ve OV-TL16 antikorlu çıplak farelerde OVCAR-3 ksenograftlarının kombinasyon kemoterapisi ve fotodinamik tedavisinin etkinliği hedeflenen HPMA kopolimer konjugatları. OVCAR-3 ksenograftlarına yönelik OV-TL 16 antikorları ile hedeflenen HPMA kopolimere bağlı Mce6 (P (GFLG) -Mce6) ve DOX (P (GFLG) -DOX) kombinasyon tedavisinin terapötik etkinliği, tedavi edilmemiş ksenograftlar ve Hedeflenen kombinasyon kemoterapi ve fotodinamik terapi. Hedefli kombinasyon terapisinin eşdeğer dozları, hedeflenmemiş kombinasyon terapisine kıyasla tümör baskılayıcı etkiyi arttırdı. Uygulanan doz: 2,2 mg / kg DOX eşdeğeri ve 1,5 mg / kg Mce6 eşdeğeri. Fotodinamik terapi için ışınlama: 650 nm, 200 mW / cm2 uygulamadan 18 saat sonra [83, yayınlanmamış].
Kombinasyon indeksi (CI) analizi, serbest ve HPMA kopolimer bağlı antikanser ilaçların ikili kombinasyonlarının, 2,5-bis (5-hidroksimetil-2-tienil) furan'ın (SOS) sinerjizmi, antagonizması ve ilave etkilerini ölçmek için kullanıldı. İnsan böbrek karsinomu A498 hücrelerine karşı antikanser etkisinde, DOX ve mezoklorin e6 mono-etilendiamin (Mce6). SOS + DOX kombinasyonunun, tüm hücre büyümesi inhibisyon seviyelerinde sinerjik olduğu kanıtlandı. Diğer tüm kombinasyonlar, geniş bir ilaç etki seviyeleri aralığında sinerji sergilemiştir [117]. Benzer şekilde, hedeflenen (OV-TL16 antikorunun Fab'si kullanılarak) ve hedeflenmemiş hedeflenen HPMA kopolimer-ilaç konjugatları, P (GFLG) -Mce6 ve P (GFLG) -SOS, insan yumurtalık karsinomu OVCAR-3 hücrelerine karşı değerlendirildi. Çoğu kombinasyonun sinerjik etkiler ürettiği gözlemleri, klinik çeviri için önemli olacaktır [118].
Satchi-Fainaro'nun Tel Aviv Üniversitesi'ndeki laboratuvarı ile işbirliği içinde, kombine hedeflenmiş polimere bağlı anjiyogenez inhibitörleri kullanan kemik neoplazmaları için yeni bir terapötik strateji geliştirildi [119]. Aminobisfosfonat alendronat (ALN) ve güçlü anti-anjiyojenik ajan TNP-470, HPMA kopolimeri ile konjuge edildi. Tersine çevrilebilir ekleme-parçalanma zincir transferi (RAFT) polimerizasyonu kullanarak, kemik dokularında aşırı ifade edilen bir proteaz olan bir katepsin K-parçalanabilir bağlayıcı taşıyan bir HPMA kopolimeri-ALN-TNP-470 konjugatı sentezledik. Serbest ve konjuge ALNTNP-470, endotelyal ve osteosarkom hücrelerinin proliferasyonunu, göçünü ve kılcal benzeri tüp oluşumunu inhibe ederek sinerjik anti-anjiyojenik ve antitümör aktivitelerini gösterdi. Bi-spesifik HPMA kopolimer konjugatı, vasküler aşırı geçirgenliği azalttı ve farelerde insan osteosarkom büyümesini% 96 oranında önemli ölçüde inhibe etti. Bu bulgular, HPMA kopolimeri-ALN-TNP-470'in, hem tümör epitel hem de endotel kompartmanlarını hedefleyen RAFT polimerizasyonu ile sentezlenen ve osteosarkomlar ve kemik metastazlarında kullanımını garantileyen ilk dar dağılmış anti-anjiyojenik konjugat olduğunu göstermektedir (Şekil 10) [119] .
Farelerde MG-63-Ras insan osteosarkom büyümesinin HPMA kopolimer-ALN-TNP470 konjugatı tarafından inhibisyonu. (A) Konjugatın yapısı; (B) serbest (açık üçgenler) veya konjuge (kapalı üçgenler) ALN ve TNP-470'in araçla tedavi edilen grup (kapalı kareler) ve kesilmiş tümör görüntüleri ile karşılaştırıldığında MG-63-Ras insan osteosarkom tümör büyümesi üzerindeki etkileri. Ölçek çubuğu 10 mm'yi temsil eder. Veriler ortalama ± S.E'yi temsil eder. (n = grup başına 5 fare). [119] 'dan uyarlanmıştır.

3.4. Yeni hedefleme stratejileri
3.1'de tartışıldığı gibi, HPMA kopolimer-ilaç konjugatları (moleküler ağırlığa bağlı) arttırılmış geçirgenlik ve tutma (EPR) etkisinin bir sonucu olarak katı tümörlerde pasif olarak birikir [85]. HPMA kopolimer-ilaç konjugatlarının aktif hedeflenmesi, karbonhidratlar, lektinler, antikorlar, antikor fragmanları ve peptitler gibi kanser hücresine özgü ligandların dahil edilmesiyle elde edilebilir, bu da, reseptör aracılı endositoz yoluyla kanser hücreleri tarafından konjugatların alımının artmasıyla sonuçlanır. terapötik etkinlikte eş zamanlı iyileşme [120,121].
Farklı kanseri hedefleyen moleküller arasında peptitler özellikle ilgi çekicidir. Geliştirilmiş peptit hedefleme verimliliği, hedefler ve tek bir polimer zinciri içinde çoklu peptit kopyaları içeren HPMA kopolimer-peptit konjugatları arasındaki multivalent etkileşimler [122] yoluyla elde edilebilir (Şekil 11) [123].
HPMA kopolimer-peptid-DOX konjugatlarının biyo-tanımasında çoklu değerlilik etkisi. Makromolekül başına değişen miktarda hedefleme peptidi, EDPGFFN-VEIPEF içeren HPMA kopolimer-DOX (P (GFLG) -DOX) konjugatına maruz bırakılarak Raji B hücre büyümesinin inhibisyonu. (A) konjugatın yapısı; (B) Raji B hücre büyümesinin P (GFLG) -DOX (hedefleyici peptit yok),% 1.9 mol hedefleme peptidi içeren P (GFLG) -DOX ve% 3.9 mol hedefleme peptidi içeren P (GFLG) -DOX tarafından inhibisyonu. [123] 'den uyarlanmıştır.
Faj gösterimi veya sentetik peptit kitaplıkları gibi kombinatoryal yaklaşımlar, hedefleme peptitlerinin tanımlanması için uygundur. CD21 reseptörünün aşırı ekspresyonu, Raji hücreleri gibi lenfoblastoid hücre çizgilerinde bulundu; sonuç olarak, bu teknikleri lenfomalar için hedefleme parçalarını belirlemek için kullandık [124,125]. Faj gösterimi ile, beş farklı peptid (RMWPSSTVNLSAGRR, PNLDFSPTCSFRFGC, GRVPSMFGGHFFFSR, RLAYWCFSGLFLLVC ve PVAAVSFVPYLVKTY) CD21 reseptörünün ligandları olarak tanımlandı. Seçilen peptitlerin ayrışma sabitlerinin mikromolar aralıkta olduğu belirlendi [124]. Sentetik bir kimyasal kombinatoryal teknik, tek boncuklu tek bileşik (OBOC) yöntemi kullanarak, CD21 reseptörü için ligand olarak dört heptapeptid (YILIHRN, PTLDPLP, LVLLTRE ve IVFLLVQ) belirledik [125]. Ayrılma sabitlerinin, faj gösterimi ile seçilen peptitlere benzer olduğu bulundu. Önemlisi, peptidler, HPMA kopolimerlerine konjuge edildikten ve çok değerlikli bir etki gösterdikten sonra CD21 reseptörüne karşı biyo-tanınabilirliklerini korumuştur [125]. Birkaç peptit hedefli HPMA kopolimer-ilaç konjugatı antikanser aktivite gösterdi [123,126,127]. Kombinatoryal kimya yaklaşımı (OBOC), yüksek kesinlikte bir tarama yöntemi ile birleştirildiğinde pikomolar afiniteye sahip peptitleri belirleyebilir [128,129].

3.4.1. İlaçların oral, kolona özgü teslimi
Kolonda seçici ilaç salımı yapabilen ilaç verme sistemlerinin geliştirilmesi büyük ilgi görmüştür. Kolona bölgeye özgü iletim, ağırlıklı olarak kolonda bulunan mikrobiyal enzim aktivitelerinin kullanılmasıyla sağlanabilir. Kolon, ince bağırsak veya mideden 5 kat daha büyük bir mikroorganizma konsantrasyonuna sahiptir. Kolondaki mikroorganizmalar tarafından üretilen enzimatik aktivitenin bir kısmı, örneğin, azoredüktaz ve glikosidaz aktiviteleri, üst GI kanalındaki enzimatik aktivitelerle örtüşmez. Azoredüktaz aktiviteleri ayrıntılı olarak çalışılmış ve düşük moleküler ağırlıklı ön ilaçları kolondaki aktif metabolitlere dönüştürmek ve ayrıca suda çözünür polimerik taşıyıcılardan aktif türleri salmak için kullanılmıştır [130]. Kolona özgü dağıtım elde etmek için, bir (aromatik amino grubu içeren) ilaç, kolonda bulunan azoredüktaz aktiviteleri ile bölünebilen bir aromatik azo bağı aracılığıyla HPMA kopolimer yan zincirlerine bağlanabilir [51,131-138]. Örneğin, aromatik bir azo bağı yoluyla HPMA kopolimerlerine bağlanan 5-aminosalisilik asidin salınımı, kolon [131], sıçanların, kobayların ve tavşanların çekum içeriği olan izole bir bakteri türü olan Streptococcus faecium kullanılarak gösterilmiştir. [133] ve insan dışkısında [133].
Son zamanlarda, 9-aminokamptotesin (9-AC) oral yolla verilmesine odaklandık. İlk olarak, aromatik azo bağı ve amino asit kalıntıları içeren bir ayırıcı aracılığıyla 9-AC'yi HPMA kopolimerlerine bağladık [134,135]. Aromatik azo bağının ilk olarak in vitro [134] ve in vivo [135] ayrıldığı, ardından amino asit (dipeptid) ilaç türevinin peptidazla katalize edilen bölünmesinin serbest 9-AC salımıyla sonuçlandığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, peptid ilaç türevinin bölünmesi, kolonda yüksek konsantrasyonlarda serbest 9-AC elde etmek için yeterince hızlı değildi. Bu sonuçlar, daha hızlı bir 9-AC salım oranına sahip bir aralayıcı içeren konjugatların tasarlanması gerektiğini gösterdi. Bu amaçla, 9-AC, aromatik azo bağı ve 1,6-eliminasyon aralayıcı içeren bir monomer tasarlandı ve sentezlendi [51]. Kolona özgü aromatik azo bağ klivajı ve 1,6-eliminasyon reaksiyonunun kombinasyonu, in vitro olarak çekal içeriği ile HPMA kopolimer konjugatından modifiye edilmemiş 9-AC'nin hızlı ve yüksek verimli bir şekilde salınmasına neden olurken, simüle edilmiş üst GI kanalında eş zamanlı stabilite ile sonuçlandı. koşullar. Konjugat, olumlu bir farmakokinetiğe [136,137] sahipti ve kolon kanseri modellerinde etkiliydi (Şekil 12) [138].
HPMA kopolimer-9-aminokamptotesin konjugatı. (A) HPMA kopolimer-9-AC konjugatlarından modifiye edilmemiş 9-AC'nin iki aşamalı bir işlemle salınmasının yapısı ve şeması - hız kontrollü aromatik azo bağı bölünmesi, ardından hızlı 1,6-eliminasyonu [51]; (B) 3 mg / kg 9-AC veya 9-AC eşdeğeri dozunda 9-AC ve P-9-AC ile tedavi edilen insan kolon karsinomu ksenograftları taşıyan farelerin hayatta kalma eğrileri [138]. Gastrointestinal sistemde hedefleme
Hücre yüzeyi glikoproteinleri, kolon epitel hücrelerinin farklılaşma ve olgunlaşma aşamasını yansıtır. Hastalıklı dokular, karsinomlar ve iltihaplı bağırsak hastalığı gibi kanser öncesi durumlar, sağlıklı olanlarla karşılaştırıldığında glikoprotein ifadesini değiştirmiştir. Sonuç olarak, lektinler, polimere bağlı ilaçlar için hedefleme parçaları olarak kullanılabilir [139-141]. WGA (buğday tohumu aglutinini) sağlıklı dokulara bağlanırken, PNA (fıstık aglutinin) hastalıklı dokulara bağlanır. HPMA kopolimer-lektin-ilaç konjugatlarının kolonik glikoproteinleri hedefleyerek hastalıklı dokulara terapötik ajanlar verebileceğini varsaydık. Normal neonatal, yetişkin ve hastalıklı kemirgen dokularında, insan inflamasyon örneklerinde ve Barrett's özofagusunda serbest ve HPMA kopolimer konjuge WGA ve PNA ve anti-Thomsen-Friedenreich (TF) antijen antikor bağlanmasının biyo-tanımasını inceledik. Yenidoğan WGA bağlanması, ilave lüminal kolumnar hücre bağlanması ile yetişkin ile karşılaştırılabilirdi. PNA bağlanması daha yaygındı; lüminal kolumnar hücre bağlanması, yaşamın ilk 2 1/2 haftasında mevcuttu. WGA bağlanması hem normal hem de hastalıklı yetişkin dokularda güçlüydü; hastalıkta hafif bir azalma kaydedildi. Normal dokularda PNA bağlanması minimaldi; hastalıkta artışlar görüldü. Anti-TF antijen antikor çalışmaları, PNA'nın antijene bağlanmadığını gösterdi. Sonuçlar, HPMA kopolimer-lektin-ilaç konjugatlarının kolit veya Barrett's özofagusu gibi durumların bölgeye özgü tedavisini sağlayabileceğini göstermektedir [141].
Çok çeşitli terapötik maddeler, onları tümör hücrelerindeki mitokondriye spesifik olarak yönlendirerek fayda sağlayabilir. Tümör ve mitokondriyal hedeflemenin bir kombinasyonunu mümkün kılacak uygulama sistemlerini tasarlamak için, mitokondriotropik ajanlar olarak trifenilfosfonyum iyonlarını kullanan [147] yeni HPMA kopolimer bazlı iletim sistemleri geliştirilmiştir [142]. Yapılar başlangıçta ilacın yerine geçen floresan etiketlerle sentezlendi ve doğrulama deneyleri için kullanıldı. Bu floresan etiketli yapılar kullanılarak gerçekleştirilen mikroenjeksiyon ve inkübasyon deneyleri, mitokondriyal hedefleme yeteneğini doğruladı [148]. Daha sonra, HPMA kopolimer-ilaç konjugatları, bir ışığa duyarlılaştırıcı mezoklorin e6 (Mce6) kullanılarak sentezlendi. HPMA kopolimerine bağlı Mce6'nın mitokondriyal hedeflemesi, hedeflenmemiş HPMA kopolimer-Mce6 konjugatlarına kıyasla sitotoksisiteyi artırdı [142]. Mevcut tasarımı uyarlamak ve diğer terapötik ajanların tümör bölgesine özgü mitokondriyal hedeflemesine izin vermek için küçük modifikasyonlar gerekebilir.
Bu türevin yeni HPMA kopolimer bazlı dağıtım sistemleri de sentezlendi [143]. Bir HPMA kopolimer-Cort-Mce6 konjugatının (lizozomal olarak bozunabilir GFLG ayırıcı yoluyla) endositoz yoluyla içselleştirilmesinden sonra, Cort-Mce6 bölündü, sitoplazmaya yer değiştirdi, GR'ye bağlandı ve çekirdeğe yer değiştirdi [143]. Kortizolün Mce6'ya bağlanmasının, nükleer lokalizasyonla sonuçlanan sitozolik GR ile bir kompleks oluşturma kapasitesini koruduğunu doğrulamak için, modifiye edilmiş ilacın hücre altı kaderini araştırdık. Cort-Mce6, yeşil floresan protein etiketli glukokortikoid reseptörü (GFP-GR) ifade eden plazmid ile transfekte edilmiş 1471.1 hücrede izlendi. Kortizol ve Mce6 sırasıyla pozitif ve negatif kontroller olarak görev yaptı. GR, bir glukokortikoid analoğunun (örneğin, kortizol) eklenmesinden sonra çekirdeğe yer değiştirmiştir. Floresan GFP etiketi, GR'nin hareketinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin verir. Veriler (Şekil 13), kortizol-Lys-Mce6 ve kortizolün zamana ve konsantrasyona bağlı çekirdek lokalizasyonunu açıkça gösterdi. Bunun aksine, Mce6 ile inkübe edilen hücreler, tedaviyi takiben reseptör lokalizasyonunda herhangi bir değişiklik göstermedi [143].
Hedefleme parçaları ve HPMA kopolimer bazlı ilaç taşıyıcıları [158] ile konjugasyon için yararlı olan bir birincil amino grubunu tanıtmak üzere GDM'nin 17-metoksi grubunun ikamesi için yeni bir yöntem geliştirdik. Farklı AR-GDM (AR = 3-aminopropil (AP), 6-aminoheksil (AH) ve 3-amino-2-hidroksipropil (AP (OH)) içeren, lizozomal olarak parçalanabilir bir GFLG ayırıcı aracılığıyla bağlanan HPMA kopolimerleri sentezlendi ve karakterize edilmiş [159] HPMA kopolimer-AR-GDM konjugatlarının sitotoksik etkinliği AR-GDM'nin yapısına bağlıydı [160].
P (AP-GDM) [HPMA kopolimer-17- (3-aminopropilamino) -17-demetoksi-geldanamisin eşleniğinin] düşük moleküler ağırlıklı GDM türevlerinin gen ekspresyon profillerini değiştirebileceği hipotezini doğrulamak için, 32P-makro-dizi analizi (Clonetech) GDM, AP-GDM ve P (AP-GDM) ile 2 kat% 50 hücre büyümesi inhibe edici konsantrasyonda (IC50) tedavi edilen insan yumurtalık karsinomu A2780 hücrelerinde gen ekspresyon profillerini değerlendirmek için kullanıldı. Kanserle ilgili yaklaşık 1200 gen, 6. ve 12. saatte değerlendirildi ve ekspresyondaki üç kat değişiklik önemli kabul edildi. Gen ekspresyon oranlarının hiyerarşik kümelenmesinin gösterdiği gibi, AP-GDM ve P (AP-GDM) tedavilerinden sonra gen ekspresyon profillerinde önemli benzerlikler bulundu [91].
Bununla birlikte, geldanamisinin etki mekanizması ile ilgili tek tek genler analiz edildiğinde sonuç farklıydı. P (AP-GDM) ile tedavi edilen hücreler, 12 saate kadar AP-GDM ile karşılaştırıldığında HSP70 ve HSP27'nin daha düşük ekspresyonunu gösterdi. Muhtemelen, düşük moleküler AP-GDM'den farklı olarak P'nin (AP-GDM) içselleştirme yolları ve hücre altı ilaç lokalizasyonu, AP-GDM tarafından indüklenen hücre stresi yanıtlarını modüle edebilir. 32P-makro-dizisinin sonuçları RT-PCR ve Western blot ile doğrulanmıştır [91]. HPMA kopolimer-AP-GDM konjugatının endositoz yoluyla içselleştirilmesinin, stresörlere ve çevresel değişikliklere duyarlı olabilen plazma membranı gibi hücrenin dış bileşenleri ile etkileşimleri engellemesi mümkündür (Şekil 15). Benzer şekilde, daha önce, HPMA kopolimer-DOX konjugatı ile muamele edilen A2780 hücrelerinin, HSP70 geninde, serbest DOX ile tedavi edilen hücrelerde gözlenenden daha belirgin bir aşağı regülasyon gösterdiğini gözlemledik [89]. Bu bulgular, AP-GDM'nin HPMA kopolimerine konjugasyonunun, AP-GDM tarafından indüklenen hücre stres yanıtlarını, içselleştirme mekanizmasındaki, hücre altı lokalizasyonundaki ve hücre içi konsantrasyon gradyanlarındaki farklılıklar nedeniyle modüle edebileceğini düşündürebilir [91].

3.7. Kanser: klinik araştırmalar
HPMA kopolimer bazlı makromoleküler terapötikler, son 20 yılda önemli ölçüde geliştirilmiştir - çok sayıda konjugat, son on yılda terapötik doğrulama için klinik denemelere girmiştir. Bunlar, HPMA kopolimer-DOX [163-165], HPMA kopolimer-DOX-galaktozamin [166], HPMA kopolimer-kamptotesin [167], HPMA kopolimer-paklitaksel [168] ve HPMA kopolimer-platinatları [169] içerir. Bu konjugatların bazılarının test edilmesinden elde edilen sonuçlar umut vericidir; umarım ilk makromoleküler terapötiklerin FDA onayı yakında gerçekleşecektir. Bölüm 4.1'de, iyileştirilmiş terapötik potansiyele sahip ikinci nesil konjugatların tasarım ilkeleri hakkındaki fikirlerimizi özetledik.

3.8. Kanserli olmayan hastalıkların tedavisinde HPMA kopolimer konjugatları
HPMA kopolimer-ilaç konjugatları, kanser dışındaki hastalıkların tedavisi için de kullanılabilir. Osteoporoz ve diğer kas-iskelet sistemi hastalıklarının tedavisi için iyi bilinen bir kemik anabolik ajan (prostaglandin E1; PGE1) ile konjuge kemik hedefli HPMA kopolimeri tasarladık [50,170-175]. Konjugatların iskelet tarafından biyo-tanımasına D-aspartik asit (D-Asp8) veya alendronatın bir oktapeptidi aracılık etti [170,172].
Bu sistem, sistemik uygulamadan sonra kemik anabolik ajanı PGE1'i spesifik olarak sert dokulara verme potansiyeline sahiptir. Kemiğe bağlandıktan sonra, PGE1 tercihen spesifik bir peptit ayırıcının katepsin K (osteoklast spesifik) katalize edilmiş hidrolizi ve ardından 1,6-eliminasyonu yoluyla daha yüksek devir hızına (daha fazla osteoklast aktivitesi) sahip bölgelerde salınacaktır [50,176]. Anabolik doz aralığında verildiğinde, salınan PGE1, net kemik oluşumunu sağlamak için kemik hücrelerinin yüzeyindeki karşılık gelen EP reseptörlerini aktive edecektir. Tasarımın ana özellikleri, D-Asp8'de veya bir PGE1 ön ilacı olan p-aminoben-ziloksikarbonil-1-prostaglandin E1'de sonlanan katepsin K-parçalanabilir oligopeptit yan zincirleri (Gly-Gly-Pro-Nle) içeren HPMA kopolimer omurgasıdır. (Şekil 17A).
HPMA kopolimer-prostaglandin E1-Asp8 konjugatının yapısı ve bunun katepsin K ile bölünmesinin mekanizması ve ardından 1,6-eliminasyonu (A) [50]; Tek bir 10 mg konjugat (n = 8) (B) enjeksiyonundan 4 hafta sonra yumurtalıkları alınmış sıçanlarda lomber vertebral cisimlerden alınan süngerimsi kemikte kemik oluşumu ölçülmüştür [174].
Bu yeni uygulama sisteminin birkaç belirgin avantajı vardır. Her şeyden önce, bir kemik bağlama parçası (D-Asp8) ve bir katepsin K (osteoklast spesifik enzim) spesifik salım mekanizması içeren çift hedefli bir salım sistemidir. PGE1'in spesifik olarak iskelete yönlendirilmesiyle, ilacın sistemik uygulanmasının yan etkileri büyük ölçüde azaltılacaktır. İkinci olarak, E-serisi prostaglandinler (PGE'ler) kemikte güçlü anabolik ajanlardır ve bu iletim sistemi, bu molekülleri iskeletteki yeni kemik oluşumunun daha faydalı olacağı yüksek devir hızına sahip bölgelere daha iyi hedefleyecektir. Üçüncüsü, sistem, sistemik uygulamadan sonra hedef (kemik) bölgede ilaç konsantrasyonunun gelişmiş kontrolüne izin verir [171,173]. Dördüncü olarak, polimerik taşıyıcı sert dokulardan elimine edilebilir ve ardından böbrek glomerüler filtrasyon yoluyla vücuttan atılabilir. Ayrıca, konjuge PGE1'in kemik dokusuna ulaşmadan önce metabolizmadan uygun şekilde korunmasını sağlar. Son zamanlarda, önerilen verme sisteminin yumurtalıkları alınmış sıçanlarda kemik erimesi bölgelerine tercihli birikimini gözlemledik; bu, daha yüksek cirolu sitelerimizi / ilaç salım hipotezimizi kuvvetle desteklemektedir [172].
Ovariektomi uygulanmış fareler üzerinde yapılan in vivo deneyler, konsepti kanıtlamıştır. Tek bir i.v. HPMA kopolimer-Asp8-PGE1 konjugatının yaşlı, yumurtalıkları alınmış sıçanlara uygulanmasında, kemik oluşum oranları 28 gün sonra ölçüldüğünde kontrollerden önemli ölçüde daha yüksekti (Şekil 17B) [173]. HPMA kopolimer konjugatları, romatoid artrit tedavisinde de başarılı olmuştur [175,177].

3.9. HPMA kopolimer konjugatlarının sentez yöntemleri
Konjugat sentezi konusu bu cilt boyunca kapsamlı bir şekilde işlenecektir. Bu bölüm boyunca birkaç yaklaşım gösterdik. Sonuç olarak, ele alınmayan bazı önemli noktalara değineceğiz.

3.9.1. İlaç ve HPMA kopolimeri arasında hidrolitik olarak bölünebilen bağ
Endozomlarda ve lizozomlarda azalmış pH nedeniyle, pH'a duyarlı bağlar hücre içi ilaç iletimi için uygundur. ADR'nin cis-akonitil bağı [177] yoluyla bağlandığı HPMA kopolimer-adriamisin (ADR = DOX) konjugatlarını sentezledik (Şekil 18). P (aconityl) -ADR'nin A2780'e duyarlı ve A2780 / AD'ye dirençli insan yumurtalık karsinomu hücrelerine karşı sitotoksisitesinin belirlenmesi, polimer konjugatının A2780 / AD hücrelerinde eksprese edilen P-glikoprotein dışa akım pompasının üstesinden gelebileceğini gösterdi [178].

3.9.2. Disülfür bağlı HPMA kopolimer-mezoklorin e6 konjugatları
Sistemik toksisite sorunlarının üstesinden gelmek için ışığa duyarlılaştırıcı mezoklorin e6 (Mce6) için yeni polimerik dağıtım sistemleri sentezlendi. Tümör dokusunda içselleştirildikten sonra Mce6'nın HPMA kopolimer omurgasından hızlı salınmasına izin vermek için bir disülfür bağı dahil edildi (Şekil 19). Sentezlenen konjugatlar, ditiyotreitole maruz kalındığında singlet oksijen üretiminin kuantum veriminde eşlik eden bir artışla birlikte zamana bağlı indirgeyici bir bölünme gösterdi. Daha hızlı salım kinetiği ve SKOV-3 insan yumurtalık karsinom hücrelerinde daha yüksek bir sitotoksisite, proteolitik olarak bölünebilen bir glisilfenilalanilleusilglisil aralayıcı ile polimer konjugatına kıyasla elde edildi. Bu yeni konjugatlar, kanserin fotodinamik tedavisi için klinik olarak ilgili ilaç dağıtım sistemleri olarak umut vaat etmektedir [179].

3.9.3. Hedefleme parçalarının eki
Hedefleme parçalarının bağlanması için kullanılan kimya, konjugatın biyo-tanınması üzerinde bir etkiye sahiptir. Birkaç antikor bağlanma yöntemini karşılaştırdık (aşağıya bakınız), antikorların HPMA kopolimerlerine eklenmesinin içselleştirme ve hücre altı trafiği [180] mekanizmasını nasıl etkilediğini araştırdık ve polimerize edilebilir antikor parçaları tasarladık [84].

3.9.4. Polimerize edilebilir antikor fragmanları
Polimerize edilebilir antikor fragmanları kullanılarak hedeflenen polimerik ilaç verme sistemlerinin sentezi için yenilikçi bir yol tasarlandı [84]. OV-TL 16 antikorunun (IgG1) polimerize edilebilir bir antikor Fab ′ fragmanı (MA-Fab ′) olan yeni bir makromonomer, poli (HPMA-co-MA-Fab ′) üretmek için HPMA ile sentezlenmiş ve kopolimerize edilmiştir (Şekil 20 ). Polimerize edilebilir Fab ′ fragmanlarını makromonomerler olarak kullanma kavramı, hedeflenen polimerik ilaç verme sistemlerinin sentezi için yeni bir paradigma sağlar ve immünolojik testler, biyosensör teknolojisi ve afinite kromatografisi gibi diğer alanlarda benzersiz uygulamalara sahip olabilir [84].

3.9.5. Antikorların HPMA kopolimerlerine bağlanmasının kimyasının konjugatların bağlanma afinitesi üzerindeki etkisi
OV-TL16 antikorunun ve onun Fab ′ fragmanının HPMA kopolimer-ilaç (ADR, Mce6) taşıyıcılarına bağlanmasına yönelik farklı yöntemlerin, konjugatların yumurtalık karsinomu (OVCAR-3) hücreleriyle ilişkili CD47 antijenine bağlanma afinitesi üzerindeki etkisi, okudu. Ab veya Fab ′'nın polimerlere kovalent olarak bağlanması için üç farklı yöntem kullanıldı [181]. Yöntem A: antikor üzerindeki amino grupları tarafından HPMA kopolimer-ilaç (ADR veya Mce6) konjugatları üzerinde aktif ester gruplarının aminolizi ile oluşturulan amid bağları yoluyla bağlanma; Yöntem B: oksitlenmiş antikor üzerindeki aldehit gruplarının HPMA kopolimeri-Mce6 konjugatları üzerindeki hidrazo grupları ile reaksiyonu sonucu oluşan hidrazon bağları yoluyla bağlanma; Yöntem C: Fabp fragmanlarının sülfhidril gruplarının HPMA kopolimeri-Mce6 konjugatının yan zincir uçları üzerindeki maleimido grupları ile reaksiyonu sonucu oluşan tiyoeter bağları yoluyla bağlanma. Şekil 21'de gösterildiği gibi Ka'daki farklılıklar gözlendi.
HPMA kopolimer konjugatlarının sentezi, özellikle moleküler ağırlık dağılımı, canlı radikal polimerizasyon yöntemleri, RAFT (tersine çevrilebilir ekleme-fragmantasyon zincir transferi) [182] ve ATRP (atom transfer radikali) polimerizasyonları [183] ​​ile kontrol edilebilir. Örneğin, RAFT kopolimerizasyonu kullanılarak makromolekül başına iki ilaç ve bir floresan etiket içeren HPMA kopolimer konjugatları yakın zamanda sentezlenmiştir [119; Şekil 10].

3.9.7. Oligonükleotidlerin bağlanması
HPMA kopolimer öncülerinin aminolizi, oligonükleotitlerin HPMA kopolimerlerine bağlanması için kullanılabilir. GG-ONp ve GFLG-ONp (ONp p-nitrofenoksidir) yan zincirleri içeren HPMA kopolimerlerine 21-mer fosforotioat oligonükleotidi (5′-TTTATAAGGGTCGATGTCCXX-3 ′) ekledik [184]. Oligonükleotid, 5′-ucunda bir birincil amine ve 3′-ucunda bir flüoreseine sahipti. HPMA kopolimer-fosforotioat oligonükleotidlerinin hepatit B virüsünün inhibe edilmesindeki hücre altı kaderi ve aktivitesi incelenmiştir. Oligonükleotitlerin, bozunmayan dipeptit GG aralayıcıları aracılığıyla HPMA kopolimerlerine kovalent olarak bağlanması, oligonükleotidin, içselleştirmeden sonra veziküllerde tutulmasıyla sonuçlandı. Oligonükleotitlerin, lizozomal olarak bölünebilen bir tetrapeptit GFLG aralayıcısı aracılığıyla bir HPMA kopolimerine konjugasyonu, lizozomdaki oligonükleotidin salınmasına ve ardından hücrelerin sitoplazması ve çekirdeğine translokasyon ile sonuçlandı. Parçalanabilir HPMA kopolimer-oligonükleotid konjugatı, lizozomdaki taşıyıcıdan salınan fosforotioat oligonükleotidlerin sitoplazma ve çekirdeğe kaçabildiğini ve aktif kalabildiğini gösteren antiviral aktiviteye sahipti. Hep G2 hücrelerinin, oligonükleotid -HPMA kopolimer konjugatları konjuge olmayan polimerlerden daha büyük ölçüde içselleştirildiği için fosforotioat oligonükleotidleri aktif olarak içselleştirdiği görülmüştür [184].

3.9.8. Hücreye nüfuz eden peptidlerin (CPP) bağlanması
HIV-1 transkripsiyonunun güçlü bir aktivatörü olan HIV-1 Tat proteininden kaynaklanan Tat peptidi (48GRKKRRQRRR57) gibi bu peptitler, çeşitli kimyasal tasarımlar kullanılarak eklenmiştir. Bir yaklaşım, birkaç amino asit kalıntısı, ör. 48GRKKRRQRRR57YK (FITC) C üretmek için. Sonuncusu, maleimidde tiyoeter bağları yoluyla sonlandırılan HPMA kopolimer yan zincirlerine bağlanabilir [185]. Yakın zamanda CPP bağlanmasının biyolojik etkilerini gözden geçirdik [144], bu yüzden burada tartışmayacağız.
4.1. Semitelechelic poly (HPMA) ile modifikasyon
Poli (HPMA) [189], enzimlerin veya veziküler taşıyıcıların modifikasyonu için kullanıldığında poli (etilen glikol) [190] ile benzer özellikler gösterir. Yarı selekelik poli (HPMA) (ST-PHPMA) hakkındaki ilk rapor 1995 yılında yayınlandı [191]. ST-PHPMA ile metil metakrilat, maleik anhidrit ve metakrilik asidin bir kopolimerine dayanan nanosferlerin modifikasyonu, in vitro olarak protein adsorpsiyonunun azalmasına ve intravasküler yarılanma ömrünün artmasına ve ayrıca intravenöz uygulamadan sonra karaciğerde birikimin azalmasına neden oldu. sıçanlar. ST-PHPMA'nın moleküler ağırlığı ne kadar yüksekse, bu özelliklerdeki değişiklikler o kadar belirgindir (Şekil 22). Bu veriler, kaplama tabakasının hidrodinamik kalınlığının, karaciğerin Kupffer hücreleri ve dalağın makrofajları tarafından opsonizasyon ve yakalama süreci üzerindeki etkisini gösteriyor gibi görünmektedir [191].
Nanosfer yüzeyini değiştirmek için ilk yarı-ekelik poli (HPMA) sentezi ve uygulaması. (Yapı; (B) IgG'nin yüzey değiştirilmiş P (MMA-MA-MAA) nanosferleri üzerine 25 ° C'de 3 saat boyunca 1/15 M salin içinde adsorpsiyon izotermleri. Her nokta ortalama ± SD'yi (n = 3) temsil eder; (C) i.v.'den 24 saat sonra farelerde modifiye edilmemiş ve modifiye edilmiş [14C] -P (MMA-MA-MAA) nanosferleri için vücut dağılım profilleri. ST-PHPMA'nın Mn ile yönetimi ve korelasyonu. Her nokta ortalama ± SD'yi (n = 5) temsil eder [191].
Benzer şekilde, kimotripsin'in ST-PHPMA-CONHNH2 ve ST-PHPMA-COOSu (N-hidroksisüksinimid ester) ile karboksil ve amino grubu modifikasyonu, PEG ile modifiye edilmiş kimotripsin [187] ile karşılaştırılabilir özelliklere sahip konjugatlar [189] üretti. Ulbrich vd. ribonükleaz, kimotripsin [192] ve süperoksit dismutazı [193] modifiye etmek için ST-PHPMA kullandı. Modifiye edilmiş proteinin proteolitik stabilitesi artmış ve immünojenisitesi azalmıştır [192,193].

4.2. Birden fazla reaktif yan zincir içeren HPMA kopolimerleriyle modifikasyon
HPMA kopolimerleri ile modifiye edilen ilk protein, HPMA kopolimerinin N-metakrililglisilglisin p-nitrofenil ester ile insülin ile reaksiyona sokulmasıyla hazırlanmıştır [28]. Reaksiyona girmemiş protein, Sephadex 75 üzerinde ayrıldı; HPMA kopolimer-insülin konjugatı, serbest insüline kıyasla sıçanlarda daha yavaş bir başlangıç ​​ve hafif bir hipoglisemik etki uzaması gösterdi [28]. Bunu kimotripsin [29,30] ve kobra zehiri asetilkolinesteraz [194] izledi.
Polimer zincirlerinin enzim-substrat kompleksi oluşumu üzerindeki sterik engeline daha iyi bir fikir edinmek için, HPMA kopolimerine bağlı olarak katalize edilen polimerik substratların (p-nitroanilide sonlandırılmış oligopeptid yan zincirlerine sahip HPMA kopolimerleri) hidrolizini inceledik. kimotripsin. Kinetik analiz, polimer substratların polimere bağlı kimotripsin ile hidrolizinin hem kcat hem de kcat / KM'de bir azalmaya yol açtığını, ancak tek tek substratlar arasındaki ilişkinin bozulmadan kaldığını gösterdi. Görünüşe göre, iki bağımsız polimer zincirinin (biri substrata, diğeri enzime bağlı) sterik etkileri kabaca katkı maddesi idi [30].
Kobra zehiri asetilkolinesterazın modifikasyonu için farklı kimya kullanılmıştır [194]. Poli (HPMA) 'nın (Mw 25-30 kDa) ikincil OH grupları, dimetilformamid içinde 4-nitrofenil kloroformat ile aktive edildi, ardından borat tamponuna asetilkolinesteraz eklendi. Poli (HPMA) ile modifiye edilmiş asetilkolinesteraz, modifiye edilmemiş enzim ile karşılaştırıldığında farelere intravenöz enjeksiyondan sonra kandaki enzim aktivitesinin 70 kat uzadığını gösterdi. PoliHPMA-asetilkolinesteraz konjugatının termoinaktivasyon hızı, doğal enziminkinden 74 kat daha küçüktü (Şekil 23) [194].
HPMA kopolimeri ile modifiye edilmiş asetilkolinesteraz. (Yapı; (B) i.v.'den sonra farelerde intravasküler yarı ömür artışı. HPMA kopolimeri ile modifiye edilmiş enzimin uygulanması; (C) HPMA kopolimeri ile modifiye edilmiş enzimin termal stabilitesinin artırılması [194].
Ribonükleaz [195] ve süperoksit dismutazın [193] modifikasyonu için N-metakrililglisilfenilfenilglisin p-nitrofenilester içeren HPMA kopolimeri kullanılmıştır. ST-PHPMA ve reaktif yan zincirlere sahip HPMA kopolimerleri kullanılarak hazırlanan konjugatların biyolojik aktivitesinde hiçbir fark tespit edilmemiştir [193].
DNA komplekslerini virüslerle stabilize etmek için reaktif yan zincirlere sahip HPMA kopolimerlerinin kullanımında önemli bir aktivite vardır. Bu araştırma, bu ciltte ve incelememizde [196] Seymour'un bölümünde yer almaktadır.

5.1. HPMA bazlı hidrojeller
İlk HPMA bazlı hidrojeller, 70'lerin başında HPMA ve metilen-bis-akrilamid veya etilen-bis-metakrilamidin çapraz bağlanması ile sentezlendi [197]. Kopolimerizasyonun kinetik seyri, polimer-su etkileşim parametresi, esneklik modülü ve elastik olarak etkili zincirlerin konsantrasyonu karakterize edildi.
Kimotripsin katalizli hidrolizine duyarlı oligopeptit çapraz bağları içeren bozunabilir hidrojeller, reaktif yan zincirler (p-nitrofenoksi gruplarında sonlandırılır) içeren HPMA kopolimerlerinin oligopeptitle (GGY, GFY, GLF, AGVY ve diaminler [49]) çapraz bağlanmasıyla sentezlendi. . Hidrojellerin bozunabilirliği, oligopeptit dizisinin uzunluğuna ve ayrıntılı yapısına ve ağ yoğunluğuna ve dolayısıyla denge şişme derecesine bağlıydı (Şekil 24). Şişme derecesi ne kadar yüksekse, bozulma oranı o kadar hızlıdır. Şişme derecesi aynı zamanda hidrojelin toplu bozunmasına karşı yüzey üzerinde bir etkiye sahiptir. Enzim hidrojelin iç kısmına dağılamazsa, sadece yüzey bozulması gerçekleşir. Bu, kimotripsin ve HPMA kopolimer bağlı kimotripsin ile katalize edilen AGVY içeren dizilerle çapraz bağlanan HPMA kopolimerinin degradasyonunun karşılaştırılmasıyla gösterilmiştir. Polimerle modifiye edilmiş enzimin daha büyük boyutuna bağlı olarak, hidrojelin sadece yüzeyde degradasyonu gözlenmiştir [49]. Çapraz bağlarda GFYAA dizisini içeren HPMA bazlı hidrojeller, bir lizozomal tiyol proteinaz olan katepsin B ile bölünebiliyordu [44]. Diğer deneylerde, bozunabilir çapraz bağlara sahip HPMA bazlı hidrojellerin, lizozomal enzimler (Tritozomlar) veya kimotripsin [198] karışımı ile inkübasyon sırasında FITC-dekstran ve daunomisin saldığı gösterilmiştir.
HPMA'nın N, O-dimetakriloil-hidroksilamin ile çapraz bağlanma kopolimerizasyonu hidrolitik olarak parçalanabilir hidrojeller üretti [199]. Bu hidrojeller, antikanser ilaç (DOX) için bir depo olarak kullanıldı; Hidrojellerden DOX salımını kullanan kombinasyon terapisinin sonuçları ve ardından antikor hedefli tedavi, farelerde Bcl1 lösemisinin terminal aşamalarının tedavisinde etkili olmuştur [200].
Hennink vd. sentezlenmiş ABA triblok kopolimerleri, burada blok A ısıya duyarlı poli (HPMA laktat) ve blok B PEG'dir. Kopolimerin ısıtılması, fotopolimerizasyon ile stabilize edilebilen (çapraz bağlanabilen) viskoelastik bir materyalin oluşumuyla sonuçlanır [202]. Bu malzemeler protein verilmesi için uygundur [203].
HPMA graft kopolimerleri, CCK-P ve CCE-P'nin antiparalel heterodimer kıvrımlı-sarmal oluşumunun aracılık ettiği hibrit hidrojellere kendi kendine montajı. İki farklı pentaheptad peptidi (CCE ve CCK), bir dimerizasyon motifi oluşturmak ve fiziksel çapraz bağlayıcılar olarak hizmet etmek için tasarlanmıştır (P, HPMA kopolimer omurgasıdır). Sulu CCE-P veya CCK-P çözeltileri jel oluşturmadı. Buna karşılık, düşük konsantrasyonlarda CCE-P / CCK-P'nin eşmolar karışımlarından jel benzeri malzemeler oluşturulmuştur [211].
Ataman Chemicals © 2015 All Rights Reserved.